试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中正五聚蛋白-3(PTX3)的含量。
实验原理:
本试剂盒应用双抗体夹心法■测定标本中人正五聚蛋白-3(PTX3)水平。用纯化的人正五聚蛋白-3(PTX3)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入正五聚蛋白-3(PTX3),再与HRP标记的正○五聚蛋白-3(PTX3)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加︻底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下↓转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的正五聚蛋白-3(PTX3)呈正相关。用酶标仪在450nm波长☆下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人正五聚蛋白-3(PTX3)浓度。
试剂盒∮组成:
试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
说明书1份1份
封板膜2片(48)2片(96)
密封袋1个1个
酶卐标包被板1×481×962-8℃保存
标准品:10.8ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存
酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
浓ζ缩洗涤液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存
样本处理及要求:
1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集∞上清,保存过程中如出现沉淀,应再↙次离心。
2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸●钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上ω 清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔◥细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应╳再次离心※。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养■上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集▓上清。检测细胞内的※成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出①细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5. 组织标本:切割标本ㄨ后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化【后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷♂冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验」。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的◎(HRP)活性。
操作步骤:
标准品▅的稀释与加样:在酶标√包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品∏100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第〇一孔、第二孔中ζ 各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分㊣别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五〗、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中△各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第○十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后←各孔加样量都为50μl,浓度分①别为7.2ng/ml,4.8ng/ml,2.4ng/ml,1.2ng/ml, 0.6ng/ml)。
加样:分别设空白@ 孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样□ 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样↑品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
温育:用封◆板膜封板后置37℃温育30分钟。
配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔ㄨ加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔♂除外。
温育:操作同3。
洗涤:操作同5。
显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色∴剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时¤蓝色立转黄色)。
测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加☆终止液后15分钟以内进行。
注意事项:
试剂盒〇从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤◣时不影响结果。
各步加样均应使用加样器,并经常校对其准→确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本∑ 数量多,推荐使用排枪加样。
请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先∑用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
底物请避光保存。
严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必▼须以酶标仪读数为准.
所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
本试剂不同批号组分不√得混用。
10. 如与英文说明书有异,以英文说『明书为准。
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐㊣ 标,
在坐〖标纸上绘出标准曲线,根据样◥品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以♀稀释
倍数;或用㊣标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值
代入方●程式,计算出样品浓度,再乘以稀释
倍数,即为样品的实际浓度。
(此图仅供参考)
试】剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%
和15%
检测范围:
0.2ng/ml -7.2ng/ml
保存条件及有效期:
1.试剂盒保◎存:;2-8℃。
2.有效期:6个月