(一) 原理

　　免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即』抗原所在。

　　(二)材料与试剂

　　1.马脾铁蛋白

　　2.硫酸铵

　　3.硫酸镉

　　4.双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如◤出现沉淀XC的多聚体形︽成，应重配。

　　5.0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液

　　6.0.1Mol/L硫酸铵液

　　7.0.05Mol/L pH 7.4 PBS液

　　(三)操作方法

　　1.铁蛋白的提取

　　⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。

　　⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓↓度为5%，混匀，4℃过夜。

　　⑶ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不∏纯沉渣。

　　⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。

　　⑸ 检查沉渣，置显微镜下□检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。

　　⑹ 以少量的①蒸馏水溶解，再加50%饱和硫◣酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。

　　⑺ 重复步骤⑹一次。

　　⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。

　　⑼ 100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。

　　⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不☉要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏↓。

　　2.铁蛋白-抗体交联法

　　⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲◣液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。

　　⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。

　　⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白-XC液，4℃搅拌48h。

　　⑷ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐∴，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。

　　⑸ 超速离心 以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。

　　⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严〖格，结果是满卐意的。

　　3.铁蛋白-抗体结合物处理标本

　　(1)将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。

　　(2)用冷的PBS液洗涤，离心。

　　(3)如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白-抗体结合物置室温20min，不时振荡,

　　(4)以冷PBS液洗涤三次，离心。

　　(5)沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。

　　(6)再以锇酸⌒　固定，脱水包埋。

　　也可以先超↑薄切片，再进行铁蛋白-抗体结合物染色。操作如下：

　　⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。

　　⑵ PBS液洗涤离心。

　　⑶ 以0.5ml,30%牛血☆清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋⌒置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。

　　⑷ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。

　　⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。

　　⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白〗蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。

　　⑺ 滴一∑　滴铁蛋白-抗体结合物于载网上。

　　⑻ 5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。

　　⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。

　　⑽ 水洗、晾干、电镜观察。

　　(四)结果判定

　　在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即⊙表示抗原的存在，判定阳性(+)，否则判为阴性(-)。