走近外泌体

　　此前，小 M 已经给大家介绍过外泌体了，它是由细☆胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小∏囊泡，广泛存¤在于血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，具有细胞信使功能，参与细胞通讯。

图1. 细胞外囊泡分类^[1]

　　外泌体是目前为▽止定义最为明确的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)，其∩生成过程、释放途径、大小及功能区别于微』囊泡 (Microvesicles) 和凋亡小体 (Apoptosis bodies)。

表 1. 外泌体、微囊泡和凋亡小体的区别

　　外泌体最早于 1983 年发现于体外培养的绵∮羊红细胞上清液中；2013 年，三位国际科学家因 “发现并阐释细◣胞囊泡运输系统及其调控机制”，获得诺贝尔生理学或√医学奖。

　　近几年，外泌体更是成为科研宠儿，几乎所有疾病∏领域都有它的身影：由于其广泛存在于各种体液中，便于获取和检测，具有疾病诊断和预后检测的应用潜力；当外泌体与靶向蛋白等一起进行基因▲工程编辑，是优选的治◢疗药物的递送方案 (生物相容性更好，低免疫原○性)。

　　今年 6 月 4 日，Nature biomedical engineering 报道了程柯教授团队 Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine 一文。该文介◣绍了构建的 SARS-CoV-2 的 RBD 抗原修饰的人源肺球细胞外泌体，作为可雾化吸入的 COVID-19 疫苗 (RBD-Exo 疫苗)，RBD-Exo 疫苗经冻干后在室▂温下稳定 3 个月以上。并且由于外泌体的强同源靶向能力，RBD-Exo 疫苗被雾化吸入后在呼吸道及肺组织表现出更长驻留时间，在动物实验中，两剂 RBD-Exo 疫苗可减弱重症肺炎，并减少 SARS-CoV-2 活病毒感染后的炎症浸润。

图 2. RBD-Exo 疫苗制备示意图^[2]

通过吸入进入肺部。RBD-Exo 诱导仓鼠产々生抗 SARS-CoV-2 感染的 RBD 特异性 IgA 和 IgG 抗体，产生黏膜免疫和全身免疫。

外泌◣体提取与纯化

　　总之，外◤泌体研究正如火如荼，想要研究好外泌体，首要任务就是获得高纯度的外泌体№，小 M 带大家一起看下常见的提取方法及各自优缺∏点吧~

表 2. 不同外泌体提取方法优缺点

　　■ 外泌体提取试剂盒▆，让高纯度外泌体☆获得更Ψ Easy!

图 3. 外泌体提取步骤

　　以上方法都可以对外泌体进行富集和纯化，大家可以根据需求选择合适的提取方法，总有一款适合你哦~

对于外泌体的标△记和鉴定

　　获得外泌体↘之后，如何对其进行鉴定又是一个困扰研究者的问ㄨ题。国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 在 2014 年提议，对于分离获得的外泌体需要从三个层面进行鉴定：

　　■ WB 检测外泌体标志蛋白表达情况

　　外泌体膜〓上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族 (CD63/CD81/CD9)、热休克蛋□　白家族 (HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90) 和一些细胞特异性蛋白⌒。其中 CD63/ TSG101 是最常用到的外泌体标志物。

　　■ TEM 鉴定⌒外泌体形态

　　电镜具有较高的分辨率，可以直接观察到样品中外泌体的形态。

　　■ NTA 检测外泌体粒径及浓度

　　TEM 可以观察外泌体的形态学特征，但无法体◆现样本中所有外泌体的粒径分布◣情况及整体浓度。NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) 技术可快速精准地分析外泌体的粒径分◎布及浓度，为外泌体鉴定提供有力证据。

上实例！

　　Muyu Yu 等人在研∑　究经阿伐他汀预处理后的骨髓间充质干细胞 (BMSC) 外泌体是否具有促血管生成能力时，对 BMSC 来源的外泌体进行了鉴↑定，如图 4 所示：透射电镜观察到各组外泌体典型的球形、膜状结构。WB 分析显示，分离的颗粒中均检测到外泌体标¤志蛋白 TSG101 和 CD81。NTA 结果表明，Exos 和 ATV-Exos 均在大约 80-120 nm 处显示★单峰。

图 4. BMSC 来源的外泌体的鉴定^[3]

　　■ 对外泌体的标记示踪

　　在对外泌体的探索中，对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪，更助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记和鉴定方法较多，主要包括亲脂性染料和膜渗透型↑化合物等。

　　01 亲脂类染々料示踪

　　亲脂类染料 (DiO, DiI, DiD, DiR) 可以很好的对外泌体进行标记，也是外泌体研究中的常用染料 。

　　体外示踪：如下图 5，Exos 和 ATV-Exos 外泌体用 PKH26红色荧光标记，细胞骨架和细胞核分别用鬼笔环肽和 DAPI 标记，激光共聚焦显微☆镜扫描结果表明：PKH26 标记的外泌体 (红) 定位于 HUVEC 细胞核周区域，证实了外泌体被内化。

图 5. HUVEC 对 Exos 和 ATV-Exos 的摄取验证^[3]

　　体内示踪：

图 6. DIR 标记 4T1 外泌体在小鼠乳腺中的体内成√像图^[4]

向有 4T1 肿瘤的Balb/c小鼠静脉注射4T1外泌体。外泌体用亲脂性荧光探针 DIR 标记；在每幅图像的右侧给出了亮度效率的刻度。

　　02 膜渗透▼型化合物示踪

　　膜渗透型化合Ψ物 CFSE 也是一种亲脂类荧光染料，可被动扩散≡进入细胞。其本身无颜色，进入细胞后脱去醋酸盐基团，生成羧ぷ基荧光素琥珀酰亚胺酯 (绿色荧光)，也常用来对外泌体进行有效示踪。

图 7. CFSE 标记胚胎组织外泌体共聚焦图像^[5]

　　看了←这么多，相信大家对外泌体有了更深【的认识。MCE 现已推」出外泌体相关产品，心动不如行动，来 MCE 官网查询具体的产品信息吧！

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　　参考文献

　　1. Naveed Akbar, Valerio Azzimato, Robin P Choudhury, Myriam Aouadi, et al. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 2019 Dec;62(12): 2179-2187.

　　2. Zhenzhen Wang, Kristen D Popowski, et al. Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine. Nat Biomed Eng. 2022 Jul 4

　　3. Muyu Yu, Wei Liu, Junxian Li, et al. Exosomes derived from atorvastatin-pretreated MSC accelerate diabetic wound repair by enhancing angiogenesis via AKT/eNOS pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Aug 12;11(1):350.

　　4. Tyson Smyth, Max Kullberg, et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. J Control Release. 2015 Feb 10; 199: 145-55.

　　5. Samantha Sheller-Miller, Jayshil Trivedi, et al. Exosomes Cause Preterm Birth in Mice: Evidence for Paracrine Signaling in Pregnancy. Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):608