CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，经典的菁染料含有两个含氮杂环，分子内部含有由甲川基 (CH)n 组成的共轭∞链，n 可为↑奇数或偶数。吸光度和荧光波长可通过选择聚次甲基桥的长度来控制：越长的花菁素具有较高的吸光度和发射波长 (图 1 所示)。根据链中的碳原子数，菁类由甲川基被分为◤一甲基 (CY1，n=0)、三甲基 (CY3，n=1)、五甲基 (CY5，n=2) 和七甲基 (CY7，n=3)。

图 1. 经典⌒花菁素结构及发射光谱示意图

CY 染料的分类

　　CY 染料分为非磺化花菁和磺化花菁。两者的光谱特性基本相同，在 DNA 和蛋█白质的标记中，它们是可互换的，两种均可用于标记生物分子。磺化花菁染料具体水溶性，且不易在水中聚集，是抗体和蛋白标记□的选择。

图 2. 共聚焦显微镜观察□患者肾、肝和肿瘤的组织切片中 Cy5 的摄取情况^[3]

文中所用 Cy5来自 MCE

CY 活化基团的选择

　　根据需要标记的生物分子的可标记基团 (胺基、醛基①或巯基) 以及酸碱⊙性，选择相应的活化染料和反应条件。为减少空间位阻影响，CY 染料常做各种修饰，具体如下：1) Succinimidyl ester (SE) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白的∮氨基末端或伯胺反应，从而实现包括多肽、抗体等的蛋白标记。标记反应∞相对于游离酸形式，空间位阻更小，反应更◣加稳定，有效；如 Shiqi Huang 等人研制出一◣种经过修饰的纳米载体，用于治疗因黑色素瘤导致的肺部肿瘤，研究人员用Cy5-SE 标记了四种修饰的纳米颗粒导入小鼠体内，并观察肺部荧光图像，进而确定纳米颗粒的聚集情况。结果表明，小♀鼠的肺部有大量的 Cy5-SE 标记的纳米颗粒靶向聚集ぷ，延缓了肿瘤的生长，该文¤章用荧光标记的方法证明了纳米╳载体抗肿瘤活性实验的可靠性。

图3. CY5-SE 标记四种修饰载体蛋白的荧光图像^[2]

　　2) Hydrazide (酰肼) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的醛基反应，多用于神经元细胞的电极失踪和Ψ神经缝隙连接硏究；该类型 CY 染料还可用于糖基化抗体的标『记；如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修饰的 CY3对四种糖基化抗体进行偶』联 (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖)，得到稳定的 CY3-Hydrazide 标记抗体。3) Maleimide (马米酰亚胺) 修饰：该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的巯基反应，实现有效标记。

CY 花菁类染料【优点

　　1) 光谱窄，信号强；

　　2) 花菁类染料的摩尔吸⌒　光系数高于其他荧光染料；3) 磺化花菁类染料易溶于水，对组织细胞毒▓性小，适用于动物和细胞实验；

　　4) 荧光波段在近红外区段的组织透过性更好。

标记反应¤操作

　　以 NHS 活化脂 CY 标记蛋白为例，如下图所示：

图 3. CY 标记蛋白操▽作流程将蛋白溶液与配置好的染料工作液倒入反应溶剂中 → 用移液器上下轻打混匀→ 常温下静置或轻微混动反应 3-5 个小时 (可过夜)→ 反应结束后进行透析除去未标记染料→ 避光放置在 4°C 保存

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　　参考文献

　　1.. X Shi, Y Jung, LJ Lin, C Liu, C Wu, IKO Cann, Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imagingNat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503

　　2. JE Noble, E Cerasoli.Fluorescent labeling of protein analysis.

　　3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.