原代细胞的培养№方法

　　原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生㊣长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

　　原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同╱一类型(上皮样或成纤维样)，但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

　　1、组织块培养法

　　组织⌒块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为▲将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分◣种类的组织细胞在小块贴壁24小★时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸Ψ ，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂『浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和↑用于实验研究。其培养方法如下：

　　(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并¤加入少许培养基使组织湿润〓。

　　(2)将小块均匀涂布⊙于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培々养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

　　(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻≡转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动∞和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清◥、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物←和漂浮小块所产生的♀毒性作用。

　　原代细胞培养-2

　　2.消化培养法

　　该方法是采用前述的消化分散法◆，将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

　　某些特↙殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等●的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

　　3.悬浮细胞培养法㊣

　　对于悬浮生长的细胞，如白血╲病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

　　4.器官培养

　　器官培养是指从供体取得器官或⌒组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的←生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移㊣　植创造了便利¤的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

　　1. 器官培养的特殊的要求

　　(1)需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供╱给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造★成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。

　　(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法：

　　① 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

　　提高培养基中☆的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2，以维持pH。

　　2. 器官∞培养的方法

　　(1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。

　　(2)将培养基加〓入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不ω要使滤膜浮起。

　　(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积♂不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。

　　(4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

　　(5)上述器官培养1~3周(每隔2~3天换液一次)后可用于实验和检测。

　　原代细胞的★培养与维持

　　(一)原代细胞培养

　　1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)

　　凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂Ψ洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度∴为10%～80%，有条件的应▃在37℃ 5% CO2的培养箱中培※养，在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。若原代贴〓壁细胞不是用于长期培养，只是用↓于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结▓果(如空斑)更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入∑新鲜的培养基，以便除去衰∞老、死亡的细胞和陈】旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。

　　若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样「纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长，为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃※去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几」次换液后，贴壁肌样细胞●逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新←瓶，然后分别补加新鲜培♀养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞╲逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也☆会逐渐长成单层，在∑　此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清(浓度要在20%以上)，以利细胞贴壁生长。

　　2、悬浮细胞的培养

　　凡来自◇外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓█的淋巴细胞、造血〓干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。若ζ作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后〖进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋□巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增〒殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明〖细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次(换液时尽量使细胞不丢失)，待细胞增殖加快，浓度明显增ω　加，pH发生明显变化时，此时可考虑①传代。但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以ξ　防传代失败。

　　(二)原代细胞的维持

　　1、贴壁细胞(包括半贴壁细胞的◇换液)

　　贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养』缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培◥养，因此，需采取换液方◣式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加※入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清︾的维持液。

　　2、悬浮细胞

　　凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而∴不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养↘无需换液，但加入生长¤因子或有丝分裂源(PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等)后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞」的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换》液培养，待达到饱→和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式√，千万不能采取倒□　去旧液加入新液的方式进行换液。半量换液的方Ψ 法如下：

　　将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基▆。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞⌒　悬液，采用低速离心(1000r/min 10min)弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再▃转入原瓶继续培养。