由于影响因素过多，细胞/组织培养中出现的一些问题往往很难分析并△得到解决，因此被人戏称为“黑色艺术”或“巫术”。本文列举了一些动物细胞/组织培养中常见的问题及解决方法。

　　1.培养试剂的保存：

　　血清：-5oC - -20oC 保存，避免反复冻融。

　　培养基: 2oC – 8oC避光保存。

　　完全培养基: 2oC – 8oC避光保存，并在2周内用完。

　　尽量缩短血清和培养基见光的时间。

　　2.液体培养基中ω　谷氨酰胺使用方法：

　　很多细胞生长要求在培养液〖中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺】的液体培养基4?C 冰箱储存两周以上时，应重新加入□　原来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成╱公司代理的GenDepot的产品Glutaplex配方中含有的成分之一) 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相ζ　比更加稳定，降解比较慢，提高㊣细胞的存活和生长，极大○降低对细胞有毒性的氨的积累。

　　3.培养基中是否应加酚红：

　　酚◣红在培养基中被用来作为pH值的指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时紫色。研究表明，酚红●可以模拟固醇类激素的作用，特别是雌激素。为◥避免固醇类反应，培︾养细胞尤其是哺乳类细胞时，应使用不加酚红的培养基。由于酚红○干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加酚红的培养基。

　　4.使用〗血清应注意的问题：

　　1)血清第一次使用前，是否应在56oC，30分钟加热血清以灭活补¤体系统?

　　激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在︽进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌↑细胞时，推荐使用热灭活々血清。实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是√不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀♀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在∩倒置显微镜下观察像是“小黑点”，常常会让研究者误以为▆是血清遭受污染。而把血清放在37℃环※境中又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省◣时间，更确保血清的质量。

　　2)通常使用◥的血清的种类：

　　新生牛血清：新出生牛5天内取血制成。小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。胎牛血清：(进口血清)要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不▆能做到，经常把出生2天以内采☆血称为胎牛血清。根据血清的ㄨ生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：(1)特级胎牛血清▼：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU，血红蛋↘白含量≤10mg/dl。(2)优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/ml。(3)标准胎牛血清◣：3次100纳米过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。

　　3)为什么储存在冰箱中的胎牛血清会№出现沉淀?

　　有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白①和脂蛋白，如冷凝集素、纤维〇蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊㊣。这应该不会影响血清的质量。建议在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

　　4)血清解冻后发现有絮状沉淀物出现：

　　血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的№原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白→(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存】在于血清中，也是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一←起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻√塞过滤膜。

　　5)如何避免沉淀¤物的产生?

　　我们建议您在使用血清的时候，注意※下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃过夜，37oC水浴解冻)。若血清解冻时改变的温度太▲大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时⊙将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成︾分也会因此受★到损害，而影响血清的质量。(4)如果在♀高于40oC的水浴中融化并且不时常摇晃混匀，非常容∩易造成沉淀物增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多，若非必要，可以省去热灭活。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的〒原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过ξ久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

　　5.培养用液pH对细◥胞生长的影响：

　　由于，大多数细胞培养适宜的pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将々产生有害的影响。各种细胞对pH的要求♀也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动☆耐受力差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液◤体的pH稍微ζ　调得偏酸一些。液体∮在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮◣动0.2左右。

　　6.培养基pH变化迅速：

　　培养箱中CO2浓度不正确。碳酸氢钠在培养液中浓度范围为2.0 – 3.7g/L时，CO2的浓度范围应分别为5% - 10%。

　　7.使用培养基时应注意的问题：

　　培养⊙基在使用前需37oC预热。细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再◥用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基ㄨ焦化，将有害物质带入培养液中。尽量□缩短各种液体、细胞的暴露时间，减少污染机会。避免液体间∮、细胞间的交叉污染。配制完全培养基↘时，配制的量最好在2周内用完为好。

　　8.细胞传代消化时胰蛋白酶的使用问题：

　　培养细胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、温度、胰酶←浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg+离子和血清等▓因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最№强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。每次进行传〇代消化前，一定要用无钙镁离子的PBS液或D-Hanks液反复冲洗细胞培养瓶，以便将含血清的培养基冲洗干净，这样可大大提高消▲化液的消化能力。通常使用的消化液【浓度为：(1)0.05%胰蛋白酶-EDTA;(2)0.25%胰蛋白酶-EDTA。多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA这种消化液。

　　第一次开瓶后应⊙立即少量分装于无菌管中，保存于–20℃，避免反复冻融造成胰蛋白酶活性降低，并可减少污染的机→会。

　　注意：如果选用无血清培养基(如启维益▲成公司代理的TNC Bio公司生产的产品 - 完全无动物成●分的血清替代品XerumFreeTM与其他培养基混合配制的无血清培养基)，在←细胞传代时，不可使用胰蛋白酶消化，因为胰蛋白酶在无血清时可去除细胞膜表面↓的受体，这种情况应使用AccutaseTM消化。

　　9.贴壁细▅胞在用蛋白酶消化时不易分离：

　　1)培养』液中存在酶的抑制剂，可使用无钙镁离子的37oC预热的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍，再消化

　　2)胰ξ酶浓度太低，使用更高浓度的胰酶，更高浓度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性

　　3)细胞处于铺〖满状态时间太长，形成细胞间的紧密连接，以后ζ注意在细胞铺满之前进行继代培养。

　　10.细＠ 胞分离后形成团块：

　　1) 细胞分散过程太过分，如用力』吹吸、酶浓度过高、消化时间过长或温度过高，酶溶∏液有毒性(如缓冲液pH或渗透压不正确等)以至基因ξ　组DNA从破裂的细胞中释放出来。解决方法是在细胞悬♂液中加入1滴无菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。

　　2)去除上清时，细胞⌒　离心的强度太大或时间太长，应使用125g, 10分钟轻微离ω　心。

　　11.悬浮细胞形成团块：

　　1)培养液中含有钙镁▽离子

　　2)支∮原体污染

　　3)由于过度消化造成¤细胞裂解，释放出基因组DNA

　　12.细胞不贴壁：

　　1)消化时间过长，细胞膜上的贴壁蛋白被◇去除了

　　2)培养基中的血清或贴■壁因子(常见于无』血清培养基)不足，可在培养基中加入贴壁≡因子或使用胶原蛋白、多聚L赖氨酸、纤连蛋白等包被的培养瓶。

　　3)支原体污染

　　13.离心动物细胞的离心速率：��

　　回收动物细胞，离心速率一般为300g，5 - 10 分钟，离心强度过大将造成细胞破裂死亡。

　　14.细胞生︼长缓慢：

　　1)换用了不同的培养基或血清，解决方法是※可比较不同培养基成分，用生长实验比较以前批次和新批次的血清，提高接种细胞数，使细胞逐步适应新的ㄨ培养基。

　　2)L-谷氨酸等促进细胞生长的成分没加入，用尽或︾分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex)替代L-谷氨酸

　　3)支原体污染或低水平细菌或真菌污染

　　4)培养试》剂保存不当

　　5)接种细胞数太少

　　6)细胞传代次数太多

　　7)细胞传代时密度太高，应在细胞铺满前的指数生长期传代

　　15.细胞死亡：

　　1)培养♂箱中无CO2，检查管子有无泄漏，是∏否需更换CO2罐，尽▂量减少开关培养箱的次数

　　2)培养箱温度不恒定

　　3)抗真菌剂或抗生素◥浓度过高，对细胞产生毒性

　　4)细胞在冻存或解冻过程中被破坏

　　5)培养基中渗透压不正确

　　6)培养基中积累了有毒的代谢产物▅

　　16.细胞冷冻培养基的成份：

　　动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，所以▂不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成々。

　　17.DMSO的等级及使用和保存：

　　冷冻保存使╱用之DMSO 等级必须为Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C。避免反复冻融造成DMSO 裂解而释出有害物质∞，并可减少污染的机会〗。若要过滤DMSO，则须使用△耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。

　　18.冻存液中的甘油的保存：

　　要避光保存，见光后甘油∩转化为对细胞有毒性的丙烯醛。

　　19.细胞欲冷冻保存时注意事项：��

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml为宜。实际操作时，建议按照细胞生产商建→议的细胞密度冻存。冻存传代次数低的细胞。

　　20.冷冻保〓存细胞之方法：��

　　冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30-60 分钟→(-20℃ 30 分钟)→ -80℃16-18 小时(或隔夜) →液氮槽vaporphase长期储存，如细胞浸在液氮＠ 中，有可能被液氮中的№微生物污染。

　　冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程◆序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至–80 ℃以下，再放』入液氮槽vapor phase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡。也可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，但存活率Ψ降低。

　　21.细胞解冻：

　　快速解冻，将37oC预热的培养基逐滴加入解冻的细胞。

　　22.支原体污染、检测及处理：

　　支原体污︼染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影◆响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无︽细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器∴。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响︻细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑√制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研∏究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现¤。

　　目前，支原体∮检测的方法有以下几种。(a)相差显微镜观卐察;(b)低张处理地衣红染色◢法;(c)荧光染色法;(d)酶标法;(e)PCR法：这是常用√的一种简便的检测方法。此方法灵敏度高，检测耗时短，样品量小(只需50ul细胞培养用液上清)，但引物及制剂费用较高。

　　支原体污染的处◣理：1)丢弃细胞，培养基及其他培养用试剂 2)重新获取未※污染细胞，新鲜培养基和试剂。