实验开始前，各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在 37℃溶解)；试剂或样品稀释时， 均需混匀，混匀时尽量避免起泡.实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数.
1. 加样：分别设空白孔，标准孔，待测样品孔.空白孔加样品稀释液 100μl，余孔分别加标 准品或待测样品 100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应 120 分钟.为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标♂准品溶液.
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤.每孔加检测溶液 A 工作液 100μl(在使用前一小时内配制) ， 酶标板加上覆膜， 37℃反应 60 分钟.
3. 温育 60 分钟后，弃去孔内Ψ液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 400μl/每孔， 甩干(也可轻拍将孔内∏液体拍干).
4. 每孔加检测溶液 B 工作液 (同检测 A 工作液) 100μl，酶标板加上覆膜 37℃反应 60 分钟 .
5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，350μl/每孔，甩干 (也可轻拍将孔内液体拍干).
6. 依序每孔加底物溶液 90μl，酶标板加上覆膜 37℃避光显色(30 分钟内，此时肉眼可见标 准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色，后 3-4 孔梯度↙不明显，即可终止).
7. 依序每孔加终止溶液 50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色.终止液的加入顺序应尽量与 底物液的加入顺序相同. 为了保证实验结果的准确∑性，底物反应时间到后应尽快加入终止液
8. 用酶联仪在 450nm 波长依序「测量各孔的光密度(OD 值). 在加终止液后立即进行检测.
