这个实验是以alkaline lysis的方法进ぷ行,其原理是将细菌←以NaOH及SDS分解,并使蛋白质及DNA变性,继的以酸中和。在此情况下,小分子质体DNA在中和后可恢復原态,但大部份的】细菌染色体DNA则无法完全復原而与 SDS-K+ 所形成的复合物一起沉淀下,可以离心去除的,上清液中所含的质体则可以酒精或異丙醇将其沉淀下來。
仪器用具:
微量离心机;冰浴
药品试剂:
MP I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 50 mM glucose)
MP II 新鲜配制 (0.2 N NaOH; 1% SDS; 使用前以10 N NaOH, 10% SDS稀△释混合配制)
MP III (3 M 醋酸钾溶液,pH 5.2,置冰浴中)
RNase A (1 mg/mL, 已经过100℃加热30 min 以去除DNase 活性)
纯酒精及70%酒精
TE-8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)
方法步骤:
1) pBlueGus/JM109, pQE31/JM109 接种于含100 μg/mL ampicillin 的LB 培养基,于37℃震荡培养过∮夜。
2) 取1.5 mL 菌液,加¤于微量离心管中,以6,000 rpm 离心2 min 后,倒去上清,以微量移液器头尽可能吸去残留液体。
◆ 两种质体均请制备三管!
3) 沉淀加入0.1 mL MP I,剧烈震荡,将沉淀完全▂打散。
4) 慢慢加入0.2 mL MP II,盖上管盖后将≡管子反复上下摇动,注意不可震荡! 此时溶液应渐澄清且黏度增加;将离心管置冰浴中。
5) 加入0.15 mL MP III,混合均匀,亦不可剧烈震荡,置冰浴中5 min。
6) 以12,000 rpm 离心5 min。
7) 小心吸出▲上清至另一离心管,加入2 倍体积♂的纯酒精 (或0.6 倍体积的isopropanol),混合均匀,置室温2 min。
8) 以12,000 rpm 离心10 min。倒去上清液,沉淀以70%酒精々洗二次,每次◥各离心1 min。
◆ 小心不要把沉淀也倒掉了!
9) 倒去上清液后,将离心管置回离心机,短暂离◥心后取出,以微量移液器头尽可能吸去残留液体。将管盖打开▂,置室温中让沉淀干燥。待沉淀干燥后,以30 μL TE-8.0 溶解 (可以微量移液器头反≡复缓慢吸放溶液,以助溶解)。
10) 加入1 μL RNase A。
11) 进行限制酶切割▓、电泳分析等实@验。