一、设施：

　　1实验室房间.　　2.超净工作台.　　3冰箱：4℃冰箱和低温冰箱。 4显微镜(倒置显微镜+摄像系统)。

　　5二氧化碳孵箱。　　6离心机。　　7恒温水浴箱。　　　8深低温保存设备：层析降温仪，液氮装置。

　　9抽滤装置和水纯化装置。　　　　10角膜内皮分析仪。　　　　11计算机。

　　二、组织培养和保存：

　　(一)、组织培养的基本概念： 把体内的细胞、组织和器官放在类似体内的体外环境中，可使其存活、生长、繁∑殖或传代。借以观察研究其生长发育、细胞形态和功能，从血分机研究某些疾病的发病机制。严格地说来，组织培养又可分细胞培养、组织「培养和器官培养。

　　1.细胞培养(cell culture) 是将机体内的组织取出分散(机械或酶消化)成为单个细〗胞，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制(contactimhibition)以及细胞衰老过程等生命现象。在细胞々培养中，细胞不再形成组织。

　　2.组织培养(tissue culture) 指组织在体外条件下维持生长，组织仍可分化并维持其结构和/或功能。需◣要说明的是，进行组织培养时，不论采用什么＠ 方法和条件，被培养组织的主ω　要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动和其他变化，这将使得培养的组织难以长期维持其特有的结构和功能。培养时间越长，发牛变动的可能性就越大。结果，常使单一类型的细胞保存下来，最终也成了细胞培养。另外，所谓细胞并不意味着细胞彼此是独立的，细胞之间仍然相↑互依存，呈现一定■组织的特性。所以，组织培养和细胞培养并无严格区别，两者在一定程度上可看作是同义语。

　　3.器官培养(organ culture) 指器官为原基、整个器官或器官的一ζ部分，在体外条件下维持生长或分化并保持结构和/或功能。 原代培养或初代培养(Primary culture)，即从体内取出◎细胞或组织的第一次培养。传代(passage)或再培养(reculture)，即把一瓶培养细胞全部或分成几份接种人另一些培养器皿中。原代培养经首次传代成功后即为细胞系(celllinne)。具有无限繁殖能力和能反复进行传代的细胞系，即为连续或无限细胞系(continuous cell line)，又称为已建细胞系(estabilshed cell line)。体外(in vitro)培养是在体外进行的生物过程的实验，现在常与组∞织培养一词通用，与体内(in vivo)相对。

　　(二)、组织︻培养的基本条件： 在体外培养细胞必须能够维持和模拟︾细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程，为此必须提供必需的营养、适宜的pH、严格的无菌条件、渗透压、培养器皿、温度和二氧化碳等条件。

　　1培养基： 目前广泛使用的培养基是化学合成培养◣基：

　　其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质;

　　(1).氨基酸(amino acid) 氨基酸是组☆成蛋白质的基本单位。所有细胞都需要酪氨酸〇、组氨酸、赖氢酸、精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等12种氨基酸。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺。谷氨酰胺具有特殊的作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮是◆核酸中嘌呤和嘧啶的◤来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。

　　(2).维生素(vitamins) 是维持细胞生长的一种生物活性物质，它在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。其中脂溶性→维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C也是不可缺少的，对※具有合成胶原能力的细胞更为重要。

　　(3).无机离子(ion) 细胞的生▂长，除了需要钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素以及█碳酸氢盐和磷酸氢盐等以外，还需要铁、铜、锌等微量元素。这对调节细胞渗透压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都是必须的。

　　(4).碳水化合物(carbohydrate) 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖⌒、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。

　　(5).激素和▲生长因子(hormone and growth factor) 。

　　(6).其他成分 在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。

　　2、气体和pH值： 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧ㄨ和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。 一些细『胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细㊣　胞于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中培养。 二氧化碳◥既是细胞代谢产物，也是细←胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7.2。7.4c在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。为了维★持培养液pH值的恒定，通常加入NaHC03来调节。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳▓，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺→点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。

　　3、培养瓶和培养皿： 培养细胞的性质不同，所采用的培养器皿也不向。单层培养可采用塑料或玻璃瓶。半固体培养可采用胶原或琼脂等凝胶，通常使用长方型的玻璃培养瓶，其优点是可以清洗、消毒〓和反复使用，但仍有被污染的可能性c国外已普遍采用系列化塑料制品，一次性使用后即弃¤去。其优点是方便、可靠，但成本较高，国内尚不能普遍应用。

　　4、温度： 培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35C—37C。偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。温度不∮超过39C时，细胞代谢强度与温度成正比;细胞培养置♀于39C—40C环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复;当温度达43C以上时，许多细胞将死亡。 当温度下降到30Y—20C时，细胞代谢♀降低，因而与培养基之间物质交换减少。 首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。当培养物恢复到初始的培 养温度时，它们原有◥的形态和代谢也随之恢复到原有水平。

　　(三)、组织细胞的保存： 为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和◥购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃—-196C)的特点。

　　细胞深低温保存的基本原理是：在-79C以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完▓全停止状态，故可以长期保存。细胞╳低温保存的关键，在于通过0C-20C阶段■的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。用电镜观察，可见细胞的核膜上有大量针尖样小孔。牛化∮研究发现，在此温度范围内，钾离子和钠离子集聚在细胞两侧，具有细胞毒性。因此，为了避免0C——20C冰晶的形成和细胞膜两侧离∩子平衡的破坏，需要加保护剂。目前常用的保护剂有甘油和二甲基亚矾(DM50)，它们可降低冰点，在缓慢的冻※结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在-130C以下低温中能减少冰晶形成，DMSO和甘㊣油对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围为5%—15%，一般常用10%o 为了保持细胞最高的存活率，一般采用慢冻快融的策略。标准冷冻速度以13℃/分的速度下降，当温度达—30C时，下降速率可增至15C—30C/分，到达-100C时则可迅速浸入—1%℃的液氮中。要适▅当掌握下降速度，过快将减少细胞水分∏透出，太慢则易促进冰晶形成。 复苏细胞】时，可将细胞取出后立即投入37C-40C水溶化冻融，迅速通过细胞最易受损的-50℃。此时细胞仍能生长，活力不受任何影←响。

　　(四)、组织培养■的应用： 传代细胞系可用来研究细胞的功能，如分泌的产物或与其他类型细胞的交互作用。然而，应该注意到体外的培养状态不同于活体的细▽胞环境c所以，在体外观察到的功能有时仅反映了该细胞类型的内在能力，而不是其在正常体内的能力; 当怀①疑某种疾病是代谢因素引起时，可用来自相关组织的细胞进行培养，以鉴别细胞在生理学上的内在缺陷。还可研究与活体⊙病理因素相近的某些环境或因素对正常细胞功能的影响。这些因素包括在正常活体内自然发生的动态改变，如激素水平的变化。另外，组织培养还用以测定外源性物质的毒性。 细胞培养在病毒感染的诊断和研究方面起着重要的作用。大量细胞培养可产生制造疫苗所需的病毒抗原和干扰ω　素等。角膜细胞已用于∑单疤病毒感染机制的研究。角膜上皮和内皮的培养细胞移植是目前正在〗研究的课题。

　　(五)、培养和保存用液：

　　1.平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS) 主要由无机盐和葡萄糖组成。无机盐离子不仅是细胞生命所需成分，而且在维〒持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面也起着重要的作用。少量的酚红溶液作酸碱度变化的指示剂，溶液变酸时呈黄色;变△碱时呈紫红色;中性时呈桃红色。借此很容易观察到培养液pH的变化。 Hsnks液和Earle液可作为较为完善的溶液的代表。它们之间的主要○区别是缓冲系统不同。Hanks液缓冲能力较弱，在普通空气条件下可达到平衡;Earle液＠ 含高浓度的NaHC03，缓冲能力较强，需用5%的二氧化碳平衡，办即在二氧化碳孵箱中才能达到平衡。大多数培养基以Earle液做为基础液。 由Dulbecco和Vogt制成的磷酸缓冲液(phosphate balanced solution PBS)，尤其是除去钙和镁的溶液，称为PBS(-)，常用于细胞的洗涤以及作为胰蛋白酶和EDTA的溶剂。它不含NaHCO3，便于高压灭菌。此外，它还用于制备L—谷●氨酰胺及抗菌素等培养液的附加溶液。

　　2.合成︾培养基 合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，它有一定的配方，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有〓的培养基仍在不断进行改良。对于培养基的选择，则要根据条件和习惯，难以强求“律。到目前为止∏，国外所选用的用于角膜々保存的培养基多为TC-199和低限量基础培养基(mimi-mum essential medium, MEM)。

　　3.保存液的添加成分：

　　(1)葡聚糖(dextran)：又名右旋糖酐。Sachs(1957)首次将葡聚糖加入眼球保存液来防止角膜基质层发生过度水肿。以后，McCarey和Kaufman(1974)证实角膜在添加葡聚糖的保存液中可维持功能和超微结↘构的完整。但使用该保存液保存4天后，角膜平均厚度从0.65mm增加到0.75mm，从而妨碍了常规的内皮显微镜检查。

　　(2)PH调整剂：早期，国外商业化的短期保存液，PH值很稳定。这并不奇怪，因为在组织保存液中含有一定量的碳酸氢钠。但这种稳定需要用二氧化碳气体来平衡。使用密封的保存瓶则很难维持恒定的PH值。所以，在组织培养系统中加入合成的▆pH稳定剂☆非常重要。在角膜长期灌洗实验中发现，经乙基哌〇嗪乙硫磺酸(N-2-hydrox-yethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid,HEPES)具有很好的稳定pH的性能。目前，将按15—20mM/L加入保存液，可使PH值稳定在7.3。在HEPES存在的情况下，不必强调使用PH指示剂。

　　(3)2—琉基乙醇(2—mercaptoethanol，2—ME)：2—ME对细胞的生长具有重要作用。有人认为它相当于胎牛血清的可透析组分，可直接刺激细胞生长。其活性部分是硫氢基，能使血清中含硫的化△合物还原成谷肮甘肽，诱导◥细胞增殖，这是一种非特异的激活作用，并能同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进对分裂原的反应和DNA合成。常配制成0.1mol/l的贮存液，使用时每升培养液加0.5ml。

　　(4)抗生素：尸眼的表面极易污染，随着时间的延长，细菌繁▃殖迅速增加。故应采取必要的措施来保持组织的无菌性。用力冲洗可机械性地去除大多数微生物。保存液本身也应提供一个无菌的环境。青霉素在高浓度时具有广语的杀菌作用，但维持时间比较≡短。对供体眼细菌污染情况的研究结果表明：庆大霉素和多粘菌素(polymyxin)在对抗致病菌(绿脓杆№菌和葡萄球菌)方面最为有效↘。在短期保存液中，庆大霉素(100微克、mL)可去除85%的供眼←污染ξ。因为存在有耐庆大霉素菌株，而多粘菌素对它们有100%的对抗作用，所以两者合用效果可能较佳。

　　(5)血清：血清是一般々培养基所必需含有的成分。

　　血清的作用是：

　　①营养：血清中含有各种生长因子，可刺【激细胞生长。

　　②解毒：包括抑制抗菌素的毒性。血清中含有结合毒性物质的因√子，可解除脂肪酸、重金属和蛋白质的毒性。

　　③中和胰蛋白酶的活性。

　　④提供促接触→和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

　　⑤提供一些酶、维生素、微量元素和激素ξ　等。

　　对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。

　　主要是：

　　第一、血清的成份可能有几百种之多，目前对其准◢确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困↑难;第二，血清都是批量生产，各批量之间差★异很大，而且血清保存期『至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制;

　　第三，不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。血清又可能成为病毒和◇支原体污染的来源之一。因此，寻找血清替代物已成为培养工作的一项任务。但目前更多地还是使用无血清培养基培ξ养细胞。