关于elisa实验的一些原理总结

　　ELISA 即酶联免疫吸附测定，是一类常用的免疫酶技术。主要↓方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表№面，然后利用酶标记（偶联）的抗▲体或抗原与之孵育，加入显色】剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，绘制出酶活曲线得出待测物浓度。

　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA实验中有三种必要的试剂：

　　① 固相的抗原或抗体（用于结合到固相载体上）

　　② 标记的抗原或抗体（标记物）

　　③ 作用的底物（显色剂，用于显色）

　　四种常见ELISA方法

　　1.直接ELISA

　　将抗原固定于ELISA板上，然后≡用酶标抗体直检测抗原。

　　相较于其它类型的ELISA实验，直接ELISA实◥验步骤少，检测◣速度快，不需要〓用到二抗，避免了交叉反应，测定♀结果不容易出错。但是由于◆直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA板结合，实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异◥性结合的一抗，实∮验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

　　2.间接ELISA

　　先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体与抗▂原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

　　与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标ㄨ二抗，具有更高的灵敏度，也↑需要更少的标记抗体，更经济。间接ELISA还提供了更大的∮灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二∑抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵∩育的步骤，实验周期№延长。

　　3.夹心ELISA

　　先将捕获抗体固定于ELISA板孔中，然后加入样品▂，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；如果检测＠抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称↓为间接夹心ELISA。

　　夹心ELISA的灵敏▲度高，它比直接或☆间接ELISA敏感2-5倍；同时夹心ELISA使用两种特╱异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的々方式进行检测，灵活性较高。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行◆配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间』的交叉反应是非常重要的。

　　4.竞争ELISA法

　　预先将抗原包被在ξ　固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载︻体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗＠体，则待检抗♀体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的∑抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标∏抗体，最后加底物显色。需要注意的◇是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。

　　竞争ELISA相对以上介绍的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞√争ELISA的形式。其主要优点在于可检测不纯的样品，且数据再▽现性高，但存在整体敏感性和专一性较差︼的问题。

　　ELISA常见问题与解决方法

　　1. 阴性对照出现阳性结果

　　① 样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现●交叉污染——更换试剂，小心操作。

　　② 酶标板洗涤不彻底——洗板前先将抗≡体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分●洗涤。

　　③ 抗体量过多导致非〓特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓∩度。

　　2．酶标板整体背景高

　　① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以々防止非特异性结合。

　　② 底物结合浓度过高——对底物▲进行适当稀释。

　　③ 反应时间◢过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。

　　④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶▂液。

　　⑤ 底物孵育过╱程没有避光——底物孵☉育应在避光条件下进行。