人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中凝血因子Ⅱ(FⅡ)的含量。

　　人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法实验原理：

　　本试剂盒应用双抗体夹心法※测定标本中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)水平。用◤纯化的人凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入凝血因子Ⅱ(FⅡ)，再与HRP标记的凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的∩作用下转化成z终的黄色。颜ω色的深浅和样品中的凝血因子Ⅱ(FⅡ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测♂定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)的含量。

　　人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法样本处理及①要求：

　　1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔〓细收集上清※】，保存过程中如出□　现沉淀，应再次离心。

　　2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔☆细收集上清，保存过程中如有㊣　沉淀形成，应该再次离心。

　　3. 尿液：用无菌管↘收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形◣成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

　　4. 细胞↑培养上清：检测分泌性的成份时№，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细♂胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复√冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份『。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

　　5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入●一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备∑　用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充█分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

　　6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进ξ行，提取后应尽快进行实验。若不能马上々进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

　　7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过ㄨ氧化物酶的（HRP）活性。

　　人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法操作步骤

　　1.标准品的稀释与加ξ　样：在酶标包被板上∮设标准品孔10孔，在D一、第二孔■中分别加标准品100μl，然后在D一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从D一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标◥准品稀释液50μl，混匀；然后在第◣三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀◇释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八╳孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品□　稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为240ng/ml,160ng/ml ,80ng/ml,40ng/ml,20ng/ml）。

　　2.加样：分别》设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相→同）、待测Ψ 样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品Z终稀释⌒　度为5倍）。加样将样品加↓于酶标板孔底部，尽量▅不触及孔壁，轻轻晃动▲混匀。

　　3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

　　5.洗涤：小心揭掉封板╱膜，弃去液体，甩干，每孔加满▽洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　6.加酶：每孔『加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　7.温育：操作同3。

　　8.洗涤：操作同5。

　　9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

　　10.终止：每〗孔加终止液50μl，终止反应（此⌒　时蓝色立转黄色）。

　　11.测定：以空白空调ζ　零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。