随着分子生物学的迅速发展，尤其是基因工程 的进步，越来越多的蛋白质药物逐渐被开发并应用于疾病治疗中，因此掌握将目的蛋白质最快最有效地分离提取纯化出来的方法，越来越重要，本文就蛋白质的提取、分离纯化作个介绍。

　　一、蛋白质(包括酶)的提取

　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质〗则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

　　(一)水溶液提取法

　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提』取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视▼有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时√间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低＠ 温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提取过程中㊣　的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等)。

　　下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

　　1、pH值

　　蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团◣发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

　　2、盐浓度

　　稀盐浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶◆作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔/升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等盐溶液。

　　(二)有机溶々剂提取法

　　一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁≡醇等有机溶剂，它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白的ぷ提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性〇失活。另外，丁醇提取法的pH及☉温度选择范围较广，也适用于动植物 及微生物材料。

　　二、蛋▲白质的分离纯化

　　蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

　　(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法

　　1、蛋白质的盐析

　　中性盐对蛋白质的溶解∩度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高◥时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子▃(如∴硫酸铵的SO42-和NH4+)有很强的水化力，可夺取◤蛋白质分子 的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

　　影响盐析的因▓素有：(1)温度：除对温度敏感的蛋白质在低温(4℃)操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶々解度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时◣溶解度低，更容易盐析。(2)pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解∩度最低。(3)蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉ξ　淀出来(共沉现象)。因此在盐析前要加等量∑　生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

　　蛋白质盐析常用的中性︻盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升)，在这一溶解度范围内，许多蛋白♀质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引☆起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫◇酸或氨水调节。

　　蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装△入秀析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡聚糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较︼短。

　　2、等电〖点沉淀法

　　蛋白质在等电点时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

　　3、低温有机溶剂沉淀法

　　用与水可混溶的有机〓溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋¤白质较易变性，应在低温下进行。

　　(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

　　1、透析与超滤

　　透析法是利用半透膜将分子大小不同的＠蛋白质分开。

　　超滤法是利用高压力或离心力，强迫水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质Ψ被截留，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。

　　2、凝胶过滤法

　　也称分子排◢阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最◥常用的填充材料是葡聚糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异分离不同蛋白质或除去热源。

　　(三)根据蛋白质带电性质进行分离

　　蛋白质在不同pH环境中带电性质╱和电荷数量不同，可将其分开。

　　1、电泳法

　　各种蛋白【质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以▓分开。值得重视的是等∞电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

　　2、离子」交换层析法

　　离子交换剂有阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析≡柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，溶液pH大于蛋白质的等电点pI时，蛋白质带负电，用阴离子交换层析，否则相反。随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋∏白质洗脱下来。

　　(四)根据配体特异性的分离方法-亲▆和色谱法

　　亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效㊣的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据》某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。

　　亲和层析法的特点是：

　　1. 结合效率高，分离速度△快。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体;

　　2. 吸附后可用改变缓冲液的离↙子强度和pH的方法，将目标蛋白洗脱下ㄨ来，也可用更高浓度的同一配体溶液或用与№配体亲和力更强的溶液洗脱。

　　3. 依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对某一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力;高选择性(专一性)亲和层析，配基仅对某一种∏蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。

　　4. 亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误识别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，令洗脱过程中的配体不可「避免的脱落进入分离体系。

　　亲和层析法按配基的不同可分为：

　　(1)金属螯合介质

　　过渡金属离子Cu2+、Zn2+和Ni 2+等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动♂相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离：例如减少洗脱液的pH;竞争洗脱，可用不同浓度的咪唑，组氨酸，氯化铵或其他能与金属离子结合的试剂洗脱。

　　(2)小配体亲和介质

　　配↓体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、肝素和赖氨酸等等。

　　(3)抗体亲和介质

　　即免疫亲和层析，配体有★重组蛋白A和ω重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。

　　(4)颜料亲和介质

　　染料层析的效果除主要取决于染料配基与蛋白的亲和力『大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、pH值及待分离的样品的纯度有关。配体有Cibacron Blue和Procion Red两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0.1和pH大于7时操作。主要用于纯化蛋白、干扰素、凝血因子等。

　　(5)外々源凝集素亲和介质

　　配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固定相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白、膜蛋白等。

　　(6)核酸亲和介质

　　配体有AMP，polyA(U)等，纯化NADP+ 依赖脱氢酶和其他对NADP+有亲和作用的酶，或纯化mRNA-结合蛋白，聚合酶，mRNA,逆转录酶等。

　　(五)根据蛋白质的疏水性差异

　　多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面∑。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合，从而利用它来进行分离的能力。

　　高浓度盐水溶液蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的溶液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶▼液直接进样到↑柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌表达的蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。

　　(六)基因工程构建的纯化标记

　　通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。

　　1. GST融合载体

　　使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。

　　2. 蛋白A融合载体

　　使要表⌒达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。

　　3. 含组氨酸标记(Histidine-tagged)Chelating Sepharose

　　最通行的标记之一，是在蛋白」质的氨基端加上6～10个组氨酸，在一般或变性条件(如8M尿素)下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑等洗脱，或将pH降至5.9(pH4-6是一个能很好分离蛋白的区间，也用到pH3-4)使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。

　　蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不∑　同的蛋白质，因此蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

　　最后提醒一下，蛋白质的分离提取纯化是生物化学的一个重要组成部分，不过由于蛋白质广泛分布于各种不同类型的细胞核组织★中，目前尚无特别简单便捷快速的方法一次性将一种蛋白提取纯化出来，往往需ξ　联合几种方法使用才行。