过氧化物㊣　酶标记测定细胞凋♂亡

　　本实验用过氧化物酶标记测定了细胞凋亡。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

　　实验原理

　　脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶〖的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成╲异多聚体，并可与连【接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物→存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异︻准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜︾下进行观察。

　　毛◥地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%，若此卐抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则△可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

　　主要试剂

　　1. 磷酸缓冲液PBS(pH7.4)：磷酸钠盐50mM，NaCl200mM。

　　2. 蛋白酶K(200μg/ml，pH7.4)：蛋白酶K0.02g;PBS100ml。

　　3. 含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4)：H2O22.0ml;PBS缓冲液98.0ml。

　　4. TdT酶缓冲液(新鲜配)：Trlzma碱3.63g用0.1NHCl调节pH至7.2，加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸钠29.96g和氯化钴0.238g。

　　5. TdT酶反应液：TdT酶32μl;TdT酶缓冲液76μl，混匀，置于冰上备用。

　　6. 洗Ψ 涤与终止反应缓冲液：氯化钠17.4g;柠檬酸钠8.82g;ddH2O1000ml。

　　7. 0.05%二氨基联苯(DAB)溶液：DAB5mg;PBS10ml，pH7.4,临用前过▂滤后，加过氧ㄨ化氢至0.02%。

　　8. 0.5%甲基绿(pH4.0)：甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml。

　　9. 100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

　　10. 过氧化物酶标记的抗地高√辛抗体(ONCOR)。

　　实验步骤

　　1. 标本预处理：

　　1)石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次⊙，每次3min。用95%和75%乙醇♂各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug/ml)，于室温々水解15min，去除组◥织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步〗骤2进行操作。

　　2)冰冻组织切片〖预处理：将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，于室温固定①10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸(2：1)的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

　　3)培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5×107个/ml细胞于4%中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

　　2. 色缸中加入含2%过氧化氢的◥PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。

　　3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

　　4. 用滤纸小○心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54μlTdT酶反应液，置湿盒中于︼37℃反应1hr(注意：阴性染色＠对照，加不含TdT酶的反应液)。

　　5. 将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提∮起和放下一次，使液〖体轻微搅动。

　　6. 组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

　　7. 用PBS洗4次，每次5min。

　　8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液，室温显色3～6min。

　　9. 用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

　　10. 于室温用甲基绿进行复¤染10min。用蒸馏水洗3次，前两次◢将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。

　　11. 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。