实〖验方法原理
本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正→常细胞。
三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。
细胞膜是一∏选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死□时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它▲可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和◤活细胞不着色。而一些活细胞ㄨ染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于↓A-T)碱基区)，显示凋亡♀细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
实验材料
人早幼◣粒白血病HL-60细胞
试剂、试剂盒
三尖杉酯碱Tris-HclEDTA缓冲液碱性裂解液SDS醋酸钠异丙醇乙醇溴酚〓蓝蔗糖指示剂TBE电泳缓冲液琼脂糖溴乙锭PI母液Ho33342母液
仪器、耗材
荧光显微镜电泳仪电泳槽微量加样器离心管载玻片盖玻片ぷ①
实验步骤
一、试剂准备
1. 三尖杉酯碱(HT)：300μg/ml;
2. Tris-HCl(pH7.5)：100mmol/L;
3. EDTA缓冲液：5mol/L;
4. 碱性裂解液：0.2mol/L NaOH;
5. 醋酸钠：3mol/L KAc(pH4.8);
注意事项
1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确;
2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易【碎灭，观察时要尽量〗快。
其他
细胞死亡╲根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体◇和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循↑一定规律自己结束生命的自主→控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质〖网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不∩释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上∑ ，多数细〗胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件⊙下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程①中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯ㄨ状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于♀损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的】敏感程度。
