克隆的时间一⊙般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜〓太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。
克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段〒时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱←而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数¤可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。
克隆化的方法很多，包括有软琼＠脂克隆化、显微操作法、荧光激√活分离法及限稀释法等。
（一）荧光激活分离法
用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其★基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的〓线形液滴，在莱塞光激⊙发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理◣，产生信号并★与预定的信号对比，根据细胞荧光①强度及细胞大小不同，将〓细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。
（二）显微镜操作法
在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱〇中放置30min以上，倒置显微镜→下，寻找那些与周围相距甚≡远的单个细胞，将毛细管口（一头有直♀角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见△管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中●细胞移到预先加有㊣2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克※隆。
（三）有限稀释法
1．材料
（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。
（2）HT培养基
2．操作方法
（1）取出抗体阳性】孔细胞，用HT培养液制成细︾胞悬液。并取样●进行台盼兰染色，计数。
（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养【盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。
（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
（6）克隆大量⊙繁殖后，布满孔¤底的1/3～1/2时，测培养液抗体。
（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。
（四）软琼脂『克隆化
借助撒在◤软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作◇如下：
1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴■溶化后，移入45℃水浴中。
2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。
3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。
4．每块平皿加10ml，于室温中◥凝固。
5．DMEM中的＠ 细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细ω胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。
6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。
7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。
8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖◣克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶①血范围，可筛选抗羊红血球Ig。
