实验试剂1. 溶液I

　　50mmol/L葡萄糖

　　25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

　　10mmol/LEDTA(pH8.0)

　　溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在6.895×104Pa高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

　　2. 溶液Ⅱ

　　0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)

　　1%SDS

　　3. 溶液Ⅲ

　　5mol/L乙酸钾 60ml

　　冰乙酸 11.5ml

　　水 28.5ml

　　所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根∏是5mol/L。

　　4. STET

　　0.1mol/L NaCL

　　10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

　　1mmol/L EDTA(pH8.0)

　　5% Triton X-100

　　5. 溶菌酶溶液

　　10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制。

　　实验步骤1. 细菌的收获

　　1) 将2ml含相应抗生素Ψ的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养㊣　过夜。

　　2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心※机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

　　3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简●便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体︽从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继♀续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

　　2. 碱裂解法

　　1) 将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。须确使细〓菌沉淀在溶液I中完全分散，将两◣个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

　　2) 加200μl新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以☉混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上↑。

　　3) 加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之ω后将管置于冰上3-5分钟。

　　4) 用微量离』心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

　　5) 可做可不做：加等量酚：氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不∞必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。

　　6) 用2倍休积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温卐放置2分钟。

　　7) 用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

　　8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于○一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于》管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从〓管中吸出时，尽量使吸↑头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

　　9) 用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤H所术方法去掉上清，在空气★中使核酸沉淀干燥10分钟。

　　注：

　　1. 此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3-5μg。

　　2.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加」到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液ζ和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。

　　3. 此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：

　　3. 煮沸裂解

　　1) 将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。

　　2) 加25μl新配制的溶菌酶溶液，振荡3秒钟以混匀之。如果溶ζ　淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

　　3) 将离心管放入煮↓沸的水浴中，时间恰为40秒。

　　4) 用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。

　　5) 用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

　　6) 在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。

　　7) 用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。

　　8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一※张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁①的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

　　9) 加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。

　　10) 按步骤H所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。

　　11) 用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。

　　注：当从表达内切核酸酶A的大∴肠杆菌株(endA 株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2 存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。在上述方案的【步骤I之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问√题。