质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提「取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：

　　碱裂解法：此方法适用于Ψ小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

　　1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

　　2、37℃振荡培养过夜。

　　3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

　　4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

　　5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，轻轻翻转混ξ　匀，置于冰浴5 min 。

　　6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

　　7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

　　8、加入等体积的↓异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

　　9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

　　10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

　　11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中

　　煮沸法

　　1、将1.5ml培养◥液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

　　3、将菌体沉淀悬◇浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

　　5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立∞即取出。

　　6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

　　7、用无菌牙签从eppendorf管中去▓除细菌碎片。

　　8、取20ml进行电泳检查。

　　质粒DNA的大量☉提取和纯化

　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度◆的质粒》DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一Ψ 般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

　　(一)、碱法

　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质※粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的▅STE中(此步可省略)。

　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细⌒胞。

　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。

　　5、加入12ml新配制的╱溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。

　　6、加9ml用冰预冷的∞溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

　　7、4℃下5000g离心15分钟。

　　8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。

　　9、加入等体积的∑　饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

　　10、取上层水相, 加入等体ζ　积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

　　11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。

　　12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

　　13、真空★抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

　　质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定

　　琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状』高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化○乙锭染色后荧光背景最小。

　　(1)琼脂糖凝胶电泳装置

　　由于琼脂〖糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去20年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个︽人的喜恶。使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。

　　水平板凝胶通常在一块可安放ζ　于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平∏台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通¤过凝胶的全长。

　　(2)琼脂◥糖凝胶的制备

　　琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖∴在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液◣倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的【电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。

　　(3)琼脂糖凝╲胶的染色

　　电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。