利用PCR技术扩增抗体VH和VL基因,所获得的产物需要满足以下两个要求：首先,得到的产物必需是正确的目的基因,要有可靠性;其次,要获得尽可能多种类目的基因,即有多样性。因此,设计出合理的扩增引物十分重要。
哺乳动物功能性抗体基因是由种系基因在DNA水平上重排产生的。以小鼠的抗体重链为例,VH基因由V、D、J三部分构成。在小鼠第12号染色体上,大约有300种V基因、12种D基因、4种J基因,在B细胞发育过∮程中,发生基因重排,由其中一个▲V、D、J共同组成一个VH,这样在一个动物个体中可能的VH至少有15,000种。如果◣考虑到重排过程中在D区和J区连接处产生的多种变化,这一数字是大大地保守了。小鼠的VL基因是通过V-J重排产生的,估计其多样性至少有2,000种。
当前PCR引物设计所依据的数据主↓要来自已发表的抗体可变区基因序列文献,包括Kabat等人编写的《Sequence of Proteins of Immunological Interests》(1991),EMBL Database,Genbank Database。由于抗体基因编码FR区的部分比编码CDR区的部分要保守,因此可以将引物设计为FR区的互补序列。针对抗体不同亚族其FR区序列也不尽相同的特点,本室设计了一组引物以确∞保不会漏掉某一亚族。选择与FR1区段互补的序列作为5’端引物,选择与FR4互补的序列作为3’端引物(表12-1)。扩增的产物是VH或VL基因。为了便于基因克隆,还在引物外☉侧加上了合适的酶切位点,重链是XhoI-SpeI,轻链是XbaI-EcoRI。这些酶所识别的序列经计算机检索,证明很少或几乎不在抗体可变区基因内出现。在酶切位点外侧有至少两个保护碱基,通常是CC或GG,以便提高内切酶的切割效率。保护碱基越多,越利于提高限制酶切的效率◇,但是成本也会提高。
(1)引物长度一般介于17～35碱基之间,一般以20～28个碱↑基为宜,这不包括额外的内切酶识别序列和外侧的保护碱基。
(2)四种碱基在引物内的分布应尽量随机,GC含量应为大约50%。
(3)避免引物内出现多聚嘌呤或多聚嘧啶。
(4)检查5’与3’引物之间或内部是否有相互配对的情况。
(5)避免使用有明显二级结构的序⌒列,尤其是在引物3’端。
(6)在引物5’端允许少量与模板不配对的碱基存在,但在3’端的序列应与模板互补。
(7)防止引物中出现一切可能影响正常转录和〓翻译过程的序列。
目前国内外已开∩发出多种PCR引物设计软件,使引物设计更加方便、快速、准确、合理。引物设计完成后即可∑ 用DNA合成仪合成,引物使用前用OPC柱、HPLC或PAGE纯化。
利用所设计的引物,已成功地从多种杂交瘤中扩增出特异的抗体可变区基因,充分表明这套引物是成功、合理的。
