细胞培养中死活细胞测定及→细胞活⌒　力测定实验

　　细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。

　　【实验原理】

　　(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：

　　(1)死活■细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

　　(2)死活细胞在代谢上的差异：由ω于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。

　　常见的细胞染∴料有：中性红(细胞器的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。

　　① 中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。利用细胞膜的通透性差异，用来染原生动物和显示动□　植物组织中活细胞的内含物等。中性红无毒，常做活体染色的染料。

　　② 台盼蓝染卐色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞→与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜※很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。

　　③ 美蓝染色法：美蓝是↑一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对】活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活⊙细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形『态，还可以区分死、活细胞.

　　④ 甲基蓝染色法：甲基蓝染色与台盼蓝类似的染色机理。

　　(二)植物细胞质壁分离法及活体染色〖测定细胞死活

　　(1)质壁分离法：成长的植物细胞一般具有中央液泡，在中央液泡和细胞壁之间为细∑　胞质的薄层及其内外膜——液泡膜和质膜。液泡中的胞液具有一定的溶质势(或称渗透势)，而活的原生质特别是液泡膜和质膜则具有半透性。所以，当细胞与外界溶】液接触时，便与外液构成渗透系统，并可能发生水分的移动。若外液的水势低于胞液的溶质势，则水分外渗的结果可▼使原生质随着液泡一起收缩而脱离细胞壁，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而是质壁分离复原。

　　(2)活体染色法：活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细ㄨ胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间(由红变黄)，在中性或微碱性环境中，植物的︾活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞◣由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红◤的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

　　【实验步骤】

　　1、试剂的配置：

　　① 台盼蓝：4%台盼蓝母ぷ液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。

　　② 中性红：先配成1%中性红水溶▆液(1克中性红溶于100毫升蒸ㄨ馏水中)。取这种溶液1毫升，用0.6%生理盐水(或蒸馏水)稀释到50毫升，即成0.02%中性红水溶液，贮存在棕色瓶里，放在黑暗处。

　　③ 美蓝：取0.5克美蓝，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶√内。此溶液能染细胞核，还用来染细菌、血和神经组织等。

　　④ 甲基蓝：取1克甲基蓝，溶于29毫升70%酒精中，加入70毫升蒸馏水，即成1%甲基蓝染液。

　　2、染色操作步骤：略

　　3、细胞活力测定：染色过的细胞材料，放在显微镜下观察。凡未染或染色及浅的细胞是有活力的，而染色深的细胞№是无活力的死细胞。

　　4、按公式计算出细胞活力。细胞活力(%)=未染色的细胞数/观察的细胞总数 X 100%

　　【注意事项】

　　1. 台盼蓝对♂人体有毒

　　2. 对细胞进行染色时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。