PCR 技术↓新手实验指南_教育装备采购↘网

PCR的基本概念

聚合酶链式反应（Polymerasechain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直︻至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。

经典方法

PCR体系组分

DNA模板（template），含有需要扩¤增的DNA片断。

2个引物（primer），决定∑了需要扩增的起始和终止位置。

DNA聚合酶（polymerase），复∏制需要扩增的区域。

脱氧核苷三磷酸（dNTP），是指4种脱氧核糖核＠酸，用于构造新的互补链。

缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

H2O 为了保持各个组分的浓度，在体系中加水稀释

注意：部分品牌缓冲液不含有Mg2+，那么还需要添加对应〓浓度的Mg2+。酶请最后加入，水请最♀先加入。

PCR步骤

1. DNA变性

（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2. 退火

（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部♂双链。

3. 延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

PCR的循环参数

1. 预变性（Initialdenaturation）

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激ζ　活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试↓剂说明书，一般未〓修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2. 循环中的『变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全Ψ变性，可能的情况下可缩短该々步骤时间，变性时间过ㄨ长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易∮造成扩增失败。

3. 引物退火（Primer annealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4. 引物延伸

引物延▓伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长☉度较短且退火温度较高时，本↑步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5. 循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6. 最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全「，并使单链产物退火成双链。

结果分析

1、假阴性，不出现扩增条带◥

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备〒，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有︼消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板ξ　时丢失过多▅，或吸入酚。⑤模板核⊙酸变性不彻底。在酶和引物质量好▓时，不出现扩增带，极有可能卐是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随√意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶∩同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导◆致假阴性。需注意〒的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓∞度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条ω　浓度高，一条浓度低＠，造成低效★率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的⌒浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条』引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可ζ能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度√高，一条亮度〓低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失※效。④引物设计不合♂理，如引物长度不够，引物之︾间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很ζ　大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改∏变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进Ψ行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体∞积如20ul 后，再做大▲体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性㊣　温度低，变性时↙间短，极有可能出现假阴性;退火温度过◤低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过【高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生△突变或缺失，影响引「物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去Ψ互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2、假阳性

出现的PCR扩增々条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择〓的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因㊣　而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物↘太短，容易←出现假阳性。需重▆新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止【将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物╲质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等∩均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂◇用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶◇序列短，但有一定的同∞源性。可互相拼接，与引物◣互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的↓产生，可用巢式PCR方法来︼减轻或消除。

3、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成√二聚体。二是Mg2+离子浓◆度过高、退火温度过低，及PCR循环次数ζ过多有关。其次是酶的质和量，往往∩一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重※新设计引物。减低酶量或■调换另一来源的酶。降※低引物量，适当增卐加模板量，减少循◥环次数。适当提高退火温度或采用二温度点▅法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

4、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模╱板量，减少循环次数。

问答

Q1.PCR各组分应该按照什么顺序怎么添加』？

A. 水-buffer-dNTP或Mg+-酶，分装，模板。

Q 2．要如何设计对照实验？

A. PCR一般要设两个∞对照：

阳性对照：用比较容易扩增出来的体系。比如以前次次都可以扩出来的体系，也可以用16s的，因为这个最好扩①。

阴性对照：就是你本次扩增的目的体系不加Taq酶即可。

Q 3.PCR产物是否需要用Ψ 凝胶纯化？

A. 如凝胶分析扩增产物↙只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见→其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

Q 4.模板浓度越高越好吗？