PCR的基本概念
聚合酶链式反应（Polymerasechain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。
PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高⊙温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。
经典方法
PCR体系组分
DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和ω终止位置。
DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。
脱氧核苷三磷酸（dNTP），是指4种脱氧核糖核酸，用于构造新的互补链。
缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
H2O 为了保持各个组分的浓度，在体系中加水稀释
注意：部分品牌缓冲液不含有Mg2+，那么还需要添加对应浓度的Mg2+。酶请最后加入，水◣请最先加入。
PCR步骤
1. DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作□ 用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
PCR的循环参数
1. 预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两〓分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间★过长损害酶活性，过短靶序列变性↘不彻底，易造成¤扩增失败。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度『）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略▲延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
结果分析
1、假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的●关键环节有①模板核酸的█制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有△消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时〓，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序〖亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活ξ 性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物『合成质量有问题，两条◣引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不◇对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体ぷ一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可︼能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合》理，如引物长√度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子Ψ 浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而◤不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积▅为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体★积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性╱温度低，变性■时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特∞异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时№还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列→变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引』物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短※或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的♀交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组◎或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种︽假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的∏核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼¤接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3、出现非特异性扩增◣带
PCR扩◥增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来↓源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调ω换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往№由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
