DUALmembrane系统是DUALsystems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目前市面上唯 一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。
此系统采用NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation marker为: trp1, leu2-3,报告基因为:HIS3, ADE2 和lacZ,
第 一步通过营养缺陷ㄨ型报告基因(HIS3, ADE2)进行选择性生长筛选,
进一步通〓过LacZ 报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半←定量筛选,三个独立的报告基因,受不◣同启动子的调控,降低假阳╱性几率。
原理:泛素(ubiquitin)分子量很小,由76aa 残基组成;泛素作为降解信号分子,可@ 以连接另外一种蛋白质的N 端,然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。
泛素可以人为分成◆两部分:N 端(Nub),C 端(Cub)。首先,人为地〗将泛素Nub 的3 位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI 突变为NubG)。这样与Cub 的□ 亲合力大大降低,避免了Cub 和Nub 自我结合或接近的可能性。其次,将Cub 部分与人▲工合成的LexA-VP16 转录激 活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。
正▃常条件下NubG不与Cub 结合,UBPs 也不能识别分离的泛素,转录激 活因子也不会被切下来。最 后,将要检测『的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成bait 融合蛋(bait-cub-LexA -VP16)和prey 融合蛋白(prey-NubG)。
如果bait 和prey发生相互作用,就会促使NubG 和Cub 的相互接近,被UBPs 识别,导致LexA-VP16 的解离,进入核内,从而激
活报告基因的转录。
此系统可使用四种Bait质粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,筛选︼标志均为LEU;三种Prey质粒:pPR3-C ,pPR3-SUC,pPR3-STE,筛选标志均为TRP。High5TM系列NMY51感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,经PGADT7质粒∩检测转化效率>104cfu/μg DNA 。