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品　　牌：炎熙生物

产品型号：PD-BCA-E

适用范围：高教

所在地区：上海 徐汇区

增强型BCA蛋白定量试剂盒

Enhanced Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

BSA标准品为5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%叠氮钠。

本试剂盒可供480个试管或32块96孔板测试用。

室温运输和储存。如因温度低或长时间放置出现沉淀，将︾其摇匀即可使用。BSA标准品保存在-20度，如出现微生物污染则应丢弃。

产品简介

BCA蛋白定量试剂盒是一种基于二喹啉甲酸比色法的总蛋白检测〓和定量试剂盒，比Lowry法更为优越」。BCA蛋白定量法以快Ψ速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数甚小而深受专业人士的青睐，样品中离子型和非离子型去污剂对其影响㊣　较小，检测不同蛋↘白质分子的变异系数远小于考马斯▆亮蓝。BCA法的原理：在碱性环境下，蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，二喹啉甲酸（BCA）与亚铜离子形成紫色的络合物』，这种络合物溶于水并在562 nm处产生「光吸收峰值，光吸收强度在一定范围内与蛋白质含量呈近似线性关系，因此使用比色法可以对蛋白质进行检测和定量。BCA法没有反应终点←，反应会随№着时间而持续进行；通过一段时间的孵育后，反应速度会变慢，从而可以对大量样品进行检测。

在蛋白质的大分子结构中，与BCA反应颜色形成相关的是肽键和四【种氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，以及酪氨酸ζ）。对二肽、三肽和四肽的研究表明，反应颜色的形成不仅仅是单个的功能基团效果叠加的结果。因此，蛋白浓度通常是根据标准对照∴蛋白（常用牛血清∞白蛋白BSA）推测而来的，即：将标准对照蛋白的光吸收值做一个浓度梯度标准曲线，未知样品的光吸收值参照曲线□　方程计算出蛋白浓度值。

增强型BCA蛋白定量试剂盒采用卐了浓缩型试剂配方，提高了孵育时间和温度，因此可以增加样品体积和增加光吸收值，从而能够检测更低浓度的蛋白，检测范围可低至0.5到20 μg/ml。

标准蛋白和工作液的◎配制

A. 配制※牛血清白蛋白梯度：可根据检测范围和预估的蛋白浓度来配制BSA浓度梯度，最好使用与待测样品相同的溶剂。可按比例放大或缩小，根据实际需要计算所需用量。

B. BCA工作液的配制

1. 根据需⊙要测定的未知样品和蛋白标准品的卐数量以及复孔数来计算所需的BCA工作液体积。如使用试管进行测试，每管需1.0 mL工作液, 而使用96孔板进行测试则每孔需150 µl 工作液。

2. 按 组份A:组份B:组份C = 25:24:1 的比例配制BCA工作液。组份C加入组份A+B的时候，开始会出现浑浊并随着混匀很快消失，最终混匀后溶液呈苹果绿色。配置好的工作液在室温密闭的条件下24小时内稳定。

操作步骤

1. 如在试管中进行反应，取1.0 ml的BSA蛋白梯度或者待∮测样品，放入标记好的试】管中，再每管△加入1.0 ml 工作液，充分混匀， 盖上盖子，并在60°C 孵育60 minutes, 检测范围： 0.5-20 μg/ml。

延长孵育时间会增加光吸收值；应使用水浴法加热，以使得温度均衡上升；用鼓风法升温○会导致温度不均衡，使实验〖误差增大。

2. 如需在96孔板中进行反应，则每孔放入150 μl的BSA蛋白梯度或者待测样品，再加入150 μl工作液，充分混匀，37度孵育120分钟，检测范围为2-40 μg/ml；注意温度不要高于37度，否则会出现背〗景升高和反应异常，大多【数聚苯乙烯（polystyrene）微孔板会在60度出现◣雾化现象；应使用水浴法加热。

3. 将试管或96孔¤板冷却至室温。

4. 用分光光度计或酶标仪在562 nm处读取光吸收▲值, 所有样品应在10分钟内读完。因为BCA反╳应没有终点，随着时间的推移光吸收值会继续上升，在10分■钟内读完所有样品可以避免产生明显的误√差。

5. 将BSA蛋白标准品和待测样品的光吸收值减去空白对照值，以得到的蛋白标准品光吸收值对蛋白浓度作标准ㄨ曲线，根据这个曲线方程计算待测样品的蛋白浓度。

注意事项：

· 测定蛋白浓度时，最好使未知样品的蛋白浓度处于标准拟合曲线的接近中间位置，这样获得的结果更准确。

· 通过增加孵育时间或者提高样品比例，可以提高光吸收值，从而检测■更低的蛋白量，但是会缩小检测范围，可根据实际需要进行调整，同时注意不要超过仪器的检测上限。

· 最适检→测波长为562 nm。在540 nm到590 nm区间也可进行检测①, 但标准曲线斜率和检测灵敏度都会有所降低。

· 酶标仪的检测光径比分光光度计的比色杯短，因而检测灵敏度㊣有所降低。

· 用软件对酶标仪的读ω　数进行曲线拟合时，采用best-fit polynomial equation进行拟合可以获得比线性拟合更准确的结果；手工拟合时可采用线性拟合法】。

· EDTA浓度必须小于】0.5 mM，不兼容EGTA。不适用BCA法时，请使用Bradford蛋白浓度测定法。

· 每种常用的总蛋白测定方法测定不同的蛋白时都有一些偏差。导致产生这些偏差的原因々有：蛋白质的氨基◎酸序列，等电点，蛋白的结构，特定种类的氨基酸侧链和辅基。有些种类的氨基酸侧链和辅基能对显色反应产生◥很大的影响。大部分蛋︾白测定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作为标准品来制〗作标准曲线。如果需要特别精确的检测结果，可以使用待测蛋白的纯品来制作标准曲线。

· 一些物质可以干扰BCA反应，如还原剂、络合剂，以及□强酸和强碱。还有一々些物质干扰较小，只要不超过最大兼容浓度即不影响反应的进行。

· 本产品仅限于专业人员的科学研究用。

· 为了ㄨ您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题