蛋白G检测试剂盒
品 名：蛋白G检测试剂盒(Protein G test kit)
目 录 号：NRPB15S
规 格：96孔
保 质 期：1年
一、试剂盒组成
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名称 |
体积 |
描述 |
储存 |
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10×样品稀释剂 |
30 ml |
使用前用蒸馏水稀释10倍，用于样品稀释和洗板 |
避光 2-8℃ |
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TMB显色液A液 |
6 ml |
使用时A液和B液按1:1混合，现配现用。避光，2-8℃保存。用于显色反应 |
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TMB显色液B液 |
6 ml |
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终止液 |
6 ml |
终止显色反应 |
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人免疫球蛋白（IgG） |
300 μl |
50 mg/ml，非SPG柱纯化获得，用于制作标准曲线∞ |
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重组蛋白G（SPG） |
20 μl |
1mg/ml，用于制作标准曲线 |
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酶标板 |
1块 |
已包被有抗体 |
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HRP标记抗体 |
30 μl |
二抗，25 μl用稀释剂稀释至10 ml |
-20℃ |
二、简介
链球菌G蛋白（简称SPG）是G、C型链球菌细胞壁中的一种蛋白质，能特异性地同免疫球蛋白IgG分子的Fc段结合，广泛用于单◇克隆抗体和多克隆抗体的纯化。
使用SPG柱纯化抗体时，从柱上脱落的SPG可能成为污染物。所以对洗脱样品进行脱落SPG的检⌒测十分必要。ELISA检测脱落SPG的过程中，样品中混杂的脱落SPG会与抗体形ζ成SPG-IgG复合物，增大SPG定量检测的难∩度。因此，解除上述〗复合物产生的影响是准确测定脱落SPG的关键。
本试剂盒利用“三层夹心”原理，并预先将SPG检测用特制抗体包被在酶标ω 板上。SPG结合酶标板后，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体去结合SPG，最后用TMB显色底物∞进行显色。TMB在HRP的催化下转化为蓝◎色，并在酸的终止作用下最终转化为黄色。在一定的SPG浓度范围内，其颜色深浅【与样品中SPG的含♀量呈正比。用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度（OD值），根据SPG浓度标准曲线可以计算出样品中含有的脱落SPG量。
三、实验步骤
所有试剂◤使用前均应在室温条件下（18~30℃）平衡30 min以上以恢复至室温。
3.1 样品稀释
样品需在pH6~9的缓冲液中，或用1×样品稀释剂适当稀释使其pH值在此范围内。稀释后的抗体浓度应该小于5 mg/ml。
3.2 标准品稀释
标准品：取10 μl的1 mg/ml SPG标准品，用90 μl的1×样品稀释剂□ 稀释10倍至100 μg/ml；然后取50 μl的100 μl/ml SPG，用450 μl的1×样品稀释剂稀ㄨ释10倍至10 μg/ml。按此法逐步稀释至100 ng/ml，并继续稀释至20、15、10、5、2、1、0.5 ng/ml，每个浓度500 μl。
人IgG：取250 μl的50 μg/ml IgG溶液，用2.25 ml的1×样品稀█释剂稀释10倍至5mg/ml。然后取2 ml的5 mg/ml IgG，用3 ml的1×样品稀释剂稀释至2 mg/ml。
混合：分别取250 μl 的20、15、10、5、2、1、0.5、0 ng/ml SPG标准品，同250 μl 的2 mg/ml 人IgG混合，即为500 μl含有1 mg/ml人IgG的10、7.5、5、2.5、1、0.5、0.25、0 ng/ml SPG标准品。
3.3 沸水浴预处理
将稀释好的样◣品和标准品在沸水浴中煮沸1 h（水应为沸●腾状态），冷却后将沉淀打散，12000 rpm离心2 min去除沉淀。根据需要用1×样品稀释剂稀释煮沸过的样品，做¤不同稀释度检测。稀释后的SPG应在试剂盒检测范围（0.1~10 ng/ml，柱洗脱样品SPG残留一般◆为√1~20 ng/mg）内。
3.4 加样
酶标板每孔加100 μl样品或标准品。根据需要设置重复孔数，一般2个重复以上。加样时注意将样品加于酶◥标板孔底部，尽量不触及孔壁，不能有气泡。酶标板加上¤覆膜（或盖子，本试剂盒未提供），37℃湿盒温育1 h。之后用1×样品稀释剂洗板3次，拍干。
3.5 加HRP标记抗体
将新鲜配置的HRP标记㊣抗体用1×样品稀释剂稀释400倍，每孔加100 μl。酶标板」加上覆膜，37℃湿盒温育1 h。之后用洗涤液洗涤6次，拍干。
3.6 显色
A液和B液按照1:1的比例混合】，现配现用。各孔加入100 μl混合好的TMB底物液，室温避光反应10 min。
3.7 终止
每孔加50 μl终止液终止反应。
3.8 读数
用酶标仪在450 nm波长处测定⊙OD值。
四、结果结算
4.1 计算重复样品的平←均OD值。
4.2 以OD值为纵坐标、SPG浓度为横坐标绘制标准曲线，获得线性◣公式。
每次实验均应绘制一条标准曲线用于计算。以下数据仅做参考。
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SPG（ng/ml） |
0 |
0.25 |
0.5 |
1 |
2.5 |
5 |
7.5 |
10 |
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OD450nm |
0.064 |
0.079 |
0.0855 |
0.1165 |
0.2535 |
0.412 |
0.55 |
0.666 |
4.3 未知样品的SPG浓度可由标准曲线查出，或根据╳计算公式计算（ng/ml）。
4.4 根据样品的稀释度和抗体浓度计算1 mg抗体◣中脱落SPG的含量（ng/mg）。
五、注意事项
5.1 在储存√及孵育过程中应避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防蒸发和微生物污染，避免蛋白水解酶的干扰导致※出现错误结果。
5.2 试剂≡盒保存：短期保存以标签上的标示★为准，长期保存请将试剂全部保存于-20℃。
5.3 刚开启的酶标板孔中可能会〇有少许水样物质，此为正常现▽象，不会对实验结果造成任何影响。
5.4 沸水浴的温度对样品和标准品的影响很大，一定要等水沸腾后开始计时，并且一直保持沸腾▂状态（100℃）。测试显示，不完全㊣沸腾（~90℃）状态下，IgG不无法完全沉淀，样品和标准品＠的检测信号很低。
