镍-琼脂糖凝胶FF
品 名：镍-琼脂糖凝胶FF（Ni Sepharose Fast Flow）
目 录 号：NRPB07L、NRPB07S（预装柱）
规 格：20 ml，100 ml，1L，1 ml预装柱，5 ml预装柱，10 ml预装柱
贮 存：20%乙醇，2~8℃保存。
运 输：2~25℃、常压、避光。
保 质 期：5年。
相关介绍：
镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），之后螯合Ni2+。IDA是金属螯合层析中最∩常用的配体，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有亲和♂力强、载量高、可再生重复使用等优点。
镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯☆化含有组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。组氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基质上，可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。
技术指标：
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基质 |
6%琼脂糖凝胶 |
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配基 |
-N(CH2COOH)2 |
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配基密度 |
30~40 μmol/ml |
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填料粒径 |
45~165 μm |
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最大流速 |
700 cm/h |
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推荐流速 |
50~100 cm/h |
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pH稳定性 |
pH 5~12；pH 3~14（脱镍） |
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耐反压 |
0.3 MPa |
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载量 |
≥40 mg His-tag重组蛋白/ml |
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保存条件 |
+2~8℃保存于20%乙醇溶液中 |
使用方法：
1、色谱柱装填
（1）所需材料的温度要与色谱操作温度保持一致。液体最好做脱气处理。
（2）在柱子下端加入蒸馏水以除去柱子中的空气。关闭柱子出口，在柱内保留少√量蒸馏水。
（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时需用玻璃棒引流，以减少气泡的产生，让填料自然沉降。
（4）柱压不得超过0.3 MPa。如装柱系统无法测量柱压，则控制流速不低于300 cm/h。但使用过程中一般只使用最大流速的75%。
（5）填装々好的镍-琼脂糖凝胶FF柱用2~5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。建议流速为100 cm/h。
2、上样
（1）样品一般溶解于pH6~8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10~100 mM 磷酸钠缓冲液、20~200 mM Tris-HCl缓冲液等。
（4）缓冲液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。
（5）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl， pH 7.4）作为初始缓冲液。
3、洗脱
（1）增加咪唑浓度进行洗脱是镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法。
（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。
（3）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以〖确定较佳的洗脱条件。
拓展应用：
1、更换不同的螯合离子
（1）IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱镍，用0.1~1.0 M NaOH清洗凝胶，再重新螯合镍使凝胶焕然一新。也可以螯合Cu2+，Zn2+， Co2+，Fe3+等其他金属离子进行多样纯化。
（2）脱镍：用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5~10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，最后用2~3个柱体积的0.5 M NaCl清洗残留的EDTA。
（3）螯合金属离子：用2~5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子，用5~10个柱体积的0.1~0.3 M金属盐溶液过柱以螯合金属，之后用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗以去↓除未螯合的金属离子。
（4）金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐，如NiSO4、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、PbSO4等。金属盐溶液应为中性或弱酸性，且必须经过过滤，以防止金属盐在凝胶上沉淀。
（5）Fe3+离子的螯合必须在低pH值下（如pH3）进行，以防止Fe3+产生沉淀。一般可以加入少量盐酸和硫酸保持低pH值。
2、多种洗脱方法
（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来（也可以在pH 3~4），缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐△缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0~0.5M咪唑、0~50 mM组氨酸、0~2M NH4Cl）。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH值下进行。
（3）螯合剂洗脱々：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离№子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。
（4）所有上述→情况中，缓冲液中均须加入0.15~0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用。
（5）当螯合离子配基是Cu2+时，有以下三种操作方式：
降低pH洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，pH7.4
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，pH3.5
竞争性洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，1 M NaCl，pH7.4
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，1 M NH4Cl，pH7.4
螯合剂洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，pH7.4
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH7.4
注：配制的缓冲液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH值。降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。最常用的方法为竞争性洗脱。
再生、清洗、保存：
1、凝胶再生
（1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法：用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5~10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，最后用2~3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。
（2）多次使用的柱子脱镍后一般需要进行清洗。清洗方法：用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1~2 h，能去除结合强的杂质，同时】也能去除热源。
（3）清洗后№需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2~5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子，用0.1~0.3 M金属盐溶液过柱5~10个柱体积以螯合金属离子，之后用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。
2、在位清洗
（1）去除因离子交换作用吸附的蛋白：2~3个柱体积的2 M NaCl溶液反向清洗。
（2）去除强疏水性⌒ 蛋白和脂质等：4个柱体积的70%乙醇或者30%异丙醇反向清洗。
（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：参照凝胶再生步骤。
