肠激酶酶切去除试剂盒
品 名：肠激酶酶切去除试剂盒（Enterokinase excision kit）
目 录 号：NRPB14S
规 格：盒
保 质 期：1年
一、试剂盒组成
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名称 |
体积 |
描述 |
储存 |
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重组牛肠激酶（rb-EK） |
1 ml |
1000 U，用于酶切重组融合蛋白 |
-20℃ |
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阳性底物 |
1 mg |
冻干粉，酶切→的阳性对照◣ |
-20℃ |
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20×酶切缓冲液 |
20 ml |
酶切◇反应体系，稀释至1×为50 mM Tris-HCl，pH8.0 |
+2-8℃ |
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STI-琼←脂糖凝胶▲FF |
1 ml |
去除rb-EK |
+2-8℃ |
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10×洗脱缓冲液 |
10 ml |
洗脱结合在∮柱子上的rb-EK，稀释至1×为50 mM Glycine-HCl, pH3.0 |
+2-8℃ |
二、简介
STI-琼脂¤糖凝胶︻FF是一种将大豆胰蛋白酶抑∩制剂（STI）键合在琼脂糖▽凝胶微球上形成的生物亲和层析分离介质。主要╳用于胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血X因子等丝氨酸蛋白酶的提取和纯化。本试剂盒中的STI-琼脂糖凝胶FF（NRPB10）可用于rb-EK的去除和回♀收，能够实现rb-EK的重复使用。
三、实验步骤
3.1 样品酶切
用1×酶切缓冲液将样品溶解或▓稀释至1~5 mg/ml，如样品中含有影响rb-EK活性的物质则需要透析至1×酶切缓冲液。根据1U的rb-EK可以酶切50 μg重组蛋白的比例↘加入相应量的rb-EK，混匀，在25℃静置酶切16 h。
3.2 阳性底物对照酶切
用1 ml 1×酶切㊣缓冲液将阳性底物溶解，取100 μl加入2U（2 μl）的rb-EK，混匀，与样品在相同条件下进行酶切。
3.3 检测
酶切前、酶切后的样品和阳性底物用SDS-PAGE检测酶切情况。
3.4 rb-EK酶的去除
1 ml STI-琼脂糖凝胶FF柱用10 ml 的1×酶切缓冲液平衡，将酶切后的样品上柱，流速以0.2 ml/min为宜，收集到的穿透液即为去除了rb-EK的样品。
3.5 rb-EK的回收
上述样品上完柱后，用2~5 ml的1×酶切缓冲液再平衡，然后用1×洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的rb-EK。收集到的洗脱液加入适量的20×酶切缓☆冲液调节pH值至中性，测定rb-EK酶活性后可以重复使用。
3.6 STI-琼脂糖凝胶FF柱保存
洗脱完rb-EK的STI-琼脂糖凝胶FF柱立即用1×酶切缓冲〓液清洗至中性，然后用5~10 ml的20%乙醇溶液清洗并保存。
五、注意事项
5.1 本试剂盒适用于含有纯化标签↘（如GST标签、His-Tag标签等）的重组蛋白的纯化。以His-Tag标签为例，大致纯化方案为：重组蛋白先用镍-琼脂糖凝胶FF（NRPB07）纯化，然后用本试剂盒将标签切除并去除rb-EK，再用镍-琼脂糖凝胶FF进一步去除标签。
5.2 经STI-琼脂糖凝胶FF柱回收后的rb-EK仍具〓有活性，可以重复使用，大幅降低了成本。
5.3 本试剂盒使用简单、方便，可以线性放『大。另有单独包装的rb-EK和STI-琼脂糖凝胶FF供应，工艺放大更加放心。
5.4 高浓度的磷酸盐会▓降低rb-EK的活性，应尽量避免使用。
