钴琼脂糖凝胶FF
品 名：钴琼脂糖凝胶FF(Co Sepharose FF, Co FF)
目 录 号：NRPB51L、NRPB51S(预装柱)
规 格：10 ml，100 ml，1L，1 ml预装柱，2 ml预装柱，5 ml预装柱，10 ml预装柱
贮 存：20%乙醇，2~8℃保存。
运 输：2~25℃、常压、避光。
保 质 期：5年。
相关介绍：
钴琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），再螯合Co2+。其中IDA是金属螯合层析中最常用的配体，与次氮基三乙酸（NTA）相比，具有亲和力强，载量高，可□再生重复使用的特点。
钴琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Co2+形成稳定的配位键，因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的钴琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度№进行竞争洗脱。
技术指标：
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基质 |
6%琼脂糖凝胶 |
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配基 |
-N(CH2COOH)2 |
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配基密度 |
30-40 μmol/ml |
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填料粒径 |
45~165 μm |
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最大流速 |
700 cm/h |
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推荐流速 |
50-100 cm/h |
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pH稳定性 |
pH 5-12，pH 3~14（脱钴） |
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耐反压 |
0.3 MPa |
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载量 |
≥40 mg/ml His-tag重组蛋白 |
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保存条件 |
+2~8℃保存于20%乙醇溶液中 |
使用方法：
1、色谱柱装填
（1）所有需要用↓到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。
（2）在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭』柱子出口，在柱内保留少◆量的蒸馏水。
（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。
（4）柱压⌒不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。
（5）填装好的钴琼脂糖凝胶FF柱用2-5个∑ 柱体积的初始缓冲溶液平衡，建议流速100cm/h，平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。
2、上样
（1）样品一般≡溶解在pH6-9的初始缓冲液中，提高上样缓冲液↓的pH值，可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬◥酸盐，也最好不含巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。
（4）在缓▂冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。
（5）在初次使用钴琼脂糖凝胶FF，推荐使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为初始缓冲液。
3、洗脱
（1）钴琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。
（2）咪∩唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。
（3）在初次使用钴琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分＠ 别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓度从低到高，分别〖洗脱和收集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定。
（4）有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。
拓展应用：
1、更换不同的◆螯合离子
（1）IDA螯合的钴琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉钴，脱掉钴后可以用0.1-1.0M NaOH进行清洗凝胶，再重新螯合钴，使凝胶焕然☆一新。也可以螯合其他金属离子，如Ni2+，Cu2+，Zn2+，Fe3+等，进∮行多样纯化。
（2）脱钴方法：用5-10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5-10个柱ζ体积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2-3个柱体积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。
（3）螯合金属离子方法：用2-5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱钴的▃柱子，用0.1-0.3M金属盐溶液过柱5-10个柱体ω 积螯合金属，螯合后用5-10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金▲属离子。
（4）金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐，如为NiSO4、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、PbSO4等，金属盐溶液应中性或弱酸性※，且必须经过过滤，以防止金属盐在胶上沉淀。
（5）如果是Fe3+必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+产生沉淀，一般可以加入少量盐酸和硫酸保持pH。
2、多种洗脱↙方法
（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH6-4会被洗脱【下来，也可以在pH 3-4，缓冲液▓可以是醋酸钠、柠檬酸、磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争↑性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0-0.5M咪唑，0-50 mM组氨酸，0-2M NH4Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。
（3）螯合㊣ 剂洗脱↘：EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋▆白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。
（4）所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15-0.5M的NaCl 以消除离子交换作用。
（5）当螯合离子配基是Cu2+时，有以下的三种操作方①式
降低pH洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，pH 7.4
洗脱缓◆冲液：50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，pH 3.5
竞争Ψ性洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，1M NaCl，pH 7.4
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，1M NH4Cl，pH 7.4
螯合剂洗脱：
上样缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，pH 7.4
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4
注：配制的缓冲∴液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH。使用降低pH和螯合剂洗脱会使¤金属离子脱落，下次使用得重新螯和金属离子，最常用的为竞争性∏洗脱。
再生、清洗、保存：
1、凝胶的再生
（1）多次使卐用后或需要更换螯合的金属离子，必须将胶脱钴再生。脱钴方法：用5-10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5-10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2-3个柱体积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。
（2）多次使█用的柱子脱钴后一般需要清洗。清洗方法：用0.1-1.0M NaOH反向清洗柱子，流速50cm/h，保持1-2h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。
（3）清洗后需要重新螯合金▼属离子。螯合方法：用2-5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱钴的柱子，用0.1-0.3M金属盐溶液过柱5-10个柱体积螯合金属，螯合后用5-10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属←离子。
2、在位清洗
（1）除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3个柱体积2M 的NaCl溶液反向清洗柱子。
（2）除去强的疏①水性蛋白和脂质等，用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。
（3）除去蛋白沉淀、疏ぷ水性蛋白，参照凝胶的再生。
