人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)使用说明
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体∩样本中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）水平。用纯化的人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入低氧诱导因子-1α（HIF-1α），再与HRP标◢记的低氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗◆涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的☆催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的低氧诱导因子-1α（HIF-1α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过︻标准曲线计算样品中人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）浓度。
试ζ剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
标准品：900pg/ml | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品稀释液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶标试剂 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
样品稀释液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
浓缩洗涤液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
样本处理及♂要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集々上清，保存过程中如出现ω 沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细◥收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次▃离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清」▆，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞↙培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保㊣ 持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试︼验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在D一、第二孔中分别①加标准品100μl，然后在D一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从D一孔、第二孔中∩各取100μl分别加到第三孔□ 和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六◆孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第↑九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为600pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml）。
2.加样：分别¤设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后→再加待测样品10μl（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸∏馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤◥液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加↙终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏∑环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入「密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避㊣ 免试验误差。一次加样时间Z好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，Z好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔D一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释○一定倍数（n倍）后再测定，计算时请Z后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污↓染。
