【基本原理】
核酸(DNA或RNA)分子探针是指能与互补核酸序列退火杂交，并可被特殊的方法探知的已知序列核酸片段。根据核酸探针标记物的性质及探针的检测方∑ 法不同，核酸探针可分为：放射性标记探针和非放射性标记探针。DNA 探针标记的█方法主要有：缺口平移法、随机引物法、末端标记法和化学标记法等。本实验采用DIG DNA Labeling andDetection Kid(地高辛标记检测试剂盒)，通过随机引物◆法标记非放射性DNA探针。标记原理是：以随机六聚体作为引物(含有各种可能排列顺序的六核苷酸混合物)，模板DNA变性后与引物一起∴退火杂交，在Ecoli DNA聚合酶Klenow片段的催化下，以单链DNA为模板，地︼高辛标记的dUTP(Dig-11-dUTP )及其他四种dNTP为原料，以随机六聚体为¤引物，合成与模板互补的DNA片段。由于在聚合反应中Dig-11-dUTP 可掺入新合成的DNA 链，因此新生的DNA 互补链具有地高辛标记，当加入抗地高辛的碱性磷》酸酶酶联抗体后，探针与抗体形成抗体半抗原复合物，在底物(NBT和BCIP)存在下，经碱性磷酸酶作用，在√杂交部位形成蓝色条带或色斑。
【器材】
1.水浴箱
2.离心机(上海创赛科技提供E23-TD5F台式过滤离心机|离心机，商品编号：E23-TD5F-台)
【试剂】
1. DIG标记检测试剂盒
2. 1×TE
3. 0.2mol/L EDTA(上海创赛科技提供60-00-4，乙※二胺四乙酸(EDTA)，EDTA标液，商品编号：16-1014183，价格288元)
4. 4mol/L LiCl
【操作步骤】
1.待标记模板DNA 1μl (含DNA 20ng -200ng)
ddH2O 14μl
沸水浴加▃热5 min ，冰浴迅◥速冷却5min。
六聚体随机引物2μl
dUTP混合物(含Dig-11-dUTP) 2μl
Klenow 酶 1μl
混匀,离心数秒，37℃水浴，4-20h 后，加入1μl 0.2mol/L EDTA 立即混匀，终止反应。
2.再加入2.5μl 4mol/L LiCl 和75μl 无水乙醇(-20℃预冷)混匀， -20℃放置1-2h ，12 000rpm 离心10min，弃上清。
3.DNA沉淀干燥后，加入50μl TE 溶液溶解，-20℃ 保存。
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