【基本原理】
利用DNA 连接酶把目的DNA 片段和载体DNA 连接在一起，成为一个新的重组分子。目的DNA片段被限制酶消化后其末端只可能有3种形式：
(1)带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也【必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外源目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。为防止载体DNA 自身环化，在连接前需除去载体分子的5’-P，使之最大限度地抑制载体环化现象。
(2)带有非互补的粘端：用两种不同的限制酶进行消化可以产☆生这样的末端、一般情□ 况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶单酶切位点;用两种酶分别消化载体和目的DNA后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。
(3)带有平末◣端：由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶Klenow片段补平3’凹陷，使不相匹配的末端转变为平端。成功的连接反应需纯净的目的DNA 片段和载体DNA 一般采用插入片段(目的DNA)与载体DNA 分子数比为∴3～5：1。目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体。根据插入片段↘和载体的分子量大小计算连接反应体系中需要加入的各DNA片段含量，计算公式如下：
【器材】
1.水浴箱
2.Eppendorf 管
3.离心机(上海创赛科技提供E23-TD5F台式过滤离心机|离心机，商品编号：E23-TD5F-台)
【试剂】
1.T4 DNA连接酶/10×T4 连接酶缓冲液
2.牛小肠〇碱性磷酸酶(CIP)/10×CIP缓冲液
3.0.5mol/L EDTA
【操作步骤】
1.建立下列去磷酸基团的反应体『系：
10×CIP 缓冲液2μl
线性化载体(已酶切) 10μl
CIP 1μl
ddH2O 7μl
2.37℃水浴1h。
3.加入2μl 0.5mol/L EDTA, 65℃灭活15min。
4.经酚/氯仿抽提，乙醇▲沉淀后，TE溶解DNA。
5.在Ep 管中建立连接反应体系：
10×连接缓冲液 2μl
DNA片段(0.2μg) 2μl
线性化的载体DNA(0.1μg) 2μl
T4DNA连接酶1μl
ddH2O 13μl
6.混匀，16℃反应数小时(5-12h)。
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