【基本原理】

　　在蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度时,蛋白质会沉淀析出，这〗种作用称为盐析，其机制与下列因素有关：蛋白质分子表面水化层被破坏;蛋白质分子所带电荷被中和。盐析沉淀的蛋白质，其性质不变，经透析或稀释后仍可溶解。盐析是可逆过程。在血清蛋白中，清蛋白占绝大部分，其余为球蛋白，在血清中加入硫酸铵至33%饱和时，γ-球蛋白被沉淀，依此可将γ-球蛋白分离出来，然后再用凝胶过滤法除盐即可得到比较纯的γ-球蛋白。

　　【器材】

　　1.层析柱

　　2.乳胶管

　　3.螺旋夹

　　4.橡皮塞

　　【试剂】

　　1.血清样品。上海创赛科技提供标准胎牛血清，Standard Fetal Bovine Serum ，商品编号：B11-S9030-200ml，价格360元。

　　2.pH7.2饱和硫酸铵：用氨水将饱和硫酸铵溶液调至pH7.2。

　　3.磷酸盐缓冲液-生理盐水(PBS)：用0.01mol/L 磷酸≡缓冲液(pH7.2)配制的0.9%NaCl溶液。上海创赛科技提供7601-54-9，磷酸钠 一元Sodium phosphate monobasic for HPLC, ≥99.0%，商品编号：C13-17844-50g，价格586.62元。

　　4.纳氏试剂。上海创赛科∩技提供纳氏试剂A液，商品编号：C49-14205-100ml，价格266元。

　　5.双缩脲试剂：CuSO4.5H2O 0.39g, 酒石酸钾钠1.2g分别溶于50ml水中，2.5N NaO60ml, KI 0.2g 与上述溶液混匀，加水至200ml。

　　【操作步骤】

　　1.血清蛋白的盐析

　　(1)将血清1.0ml 加入◤离心管中，加PBS液1.0ml，混匀，再逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵1.0ml 边加边摇匀，静置30min 后3000rpm离心10min，倾去上清(此液主要含清蛋白)。

　　(2)将离心管中的沉淀用1.0ml PBS液搅拌溶解█，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml混匀，静置30min，3000rpm离心10min，倾去上清(主要含α,β球蛋白)，其沉淀即为初步纯化的◣γ-球蛋白。若要得到更纯净的γ-球蛋白，可以重复此过程1-2次。

　　2.脱盐

　　(1)凝胶制品的预处理：取Sephadex G50 1g，放入100ml 烧杯中，加蒸馏水50ml，于沸水浴中煮沸1h ，冷却后倾去上清液，再加入PBS 10ml 备用。

　　(2)装柱：关闭出口，将Sephadex G50悬液混匀自层析柱╱顶部加入，待凝胶在柱中沉淀1-2cm高时，打开出口，同时不断加入凝胶，直至距顶部2cm 左右。继续用PBS流洗整个柱床，控制』其流速为1ml/min。操作过程中严防出现气泡或分层。如床面不平，可用玻璃棒轻轻△搅动表层，使凝胶重新自然沉降(整个过程中，切勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂)。

　　(3)加样：将床面以上的液体放出，待液面恰好与凝胶面重合时，关闭下口。用滴管吸取γ-球蛋白液，缓慢沿内壁加入(尽量¤不扰动凝胶面)。打开出口，使样品进入柱内，再陆续小心加入PBS液。

　　(4)收集：准备12 只小试管收集流出液，从加样后开始，每管收集1ml。将收集液经280nm波长测≡定后，以洗脱体积为横坐标，光密度为纵坐♀标，作出洗脱图谱。

　　(5)检测：准备二块反应板，向各孔内加入收集液各1滴，其中一块板各孔内分别加入纳氏液一滴，有NH4+者呈黄色至橙色。再向另一反应板各孔内加入▓双缩脲试剂各一滴，观察双缩脲反应并记录呈色深浅，用(-或+)表示。PDF

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