Western Blot中的三大常见问题

　　Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时，多数都用的Bio-Rad公司的仪器和abcam公司抗体，所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家，因为每天都有很多人向他们请教。他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分，希望能帮你节省一些查资料的时间。

品牌	抗体名称	货号	规格	市场价	促销价
Abcam	Anti-Chk2 (phospho T387)	ab55319	100 µg	3996.00	3196.00
Abcam	Anti-Chk1 [EPR3952]	ab133277	100 µl	4175.00	3340.00
Abcam	Anti-CDKN2A	ab189034	50 µg	3996.00	3196.00
Abcam	Anti-ATR抗体[2B5]	ab4471	100 µg	4255.00	3404.00

?　　Q：我的结果是↓膜上一片空白。为什么会这样?

　　A：导致这种结果的因素很多。

　　胶和膜放反了如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会√到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。

　　转膜效率低转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小※、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来，蛋白越大，转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近■缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。

　　在转印之后，你可以通过染胶或第①二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之ㄨ后可直接观察到。试剂放置太久或存放条件不正确抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20°C。

　　抗体不♂纯或滴度太低一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。

　　酶失活了叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活，只能使用蒸馏的去离子水。

　　使用Tween-20洗涤 Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用〗，或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使々背景升高。

　　检测系统缺乏足够的灵敏度确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内＠：

　　辣根过氧化物酶 500 pg/band
　　碱性磷酸酶 100 pg/band
　　增强的碱性磷酸酶 5 pg/band
　　胶体金 100 pg/band
　　增强的胶体金 10 pg/band
　　Immun-Star 化学发光 10 pg/band

　　Q：我的western blot总是背景过高，如何解决?

　　A：背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

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