实验试剂

　　1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]

　　2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]

　　3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混匀)

　　4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)

　　5. 异丙醇

　　6. 4 mol/L LiCI

　　7. RNase

　　8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿

　　9. 乙醇

　　实验设备

　　1. 摇床

　　2. 制冰机

　　3. 高速离心机

　　4. 水浴锅

　　5. 超净工←作台

　　6. 玻璃毛细管

　　7. 微量注射器

　　实验材料

　　棉花，转化农杆菌菌株

　　实验步骤

　　1. 37℃, 250 rpm摇菌500 ml。

　　2. 5000 × g离心5 min以收集⊙菌体，用50 ml STE洗涤菌体一次。

　　3. 加入溶液I 20 ml悬浮菌体。

　　4. 加溶液II40 ml，轻轻将离心管颠倒几次，置冰浴20 min。

　　5. 加预冷的溶液III30 ml，将离心管颠倒几次，置冰浴10 min以上。

　　6. 10000 × g离心15 mm，取〗上清液加入0.6倍体积的的异丙醇，充分〒混匀后室温放置10 min以上。

　　7. 10000 × g离心10 min，弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI，混匀后室温放置10 min以上。

　　8. 10000 × g离心5 min，取上清液加入RNase至终浓度为100 ug/ml，37℃保温2h。

　　9. 用苯酚、酚-氯仿、氯☆仿各抽提一次。上清加0.1倍体积的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。

　　10. 离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。

　　11. 棉花的遗传转化:大量的质粒，用无菌水稀〓释成2 mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作█台上进行，注射针是玻璃毛细管，顶端直↘径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头，吸取被注射的DNA样品6-12ul。注射时，将针头对准〇子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。