小课堂1222-158

　　一、贴壁细胞→蛋白提取

　　A

　　1..将水浴锅的温度调至100℃，等▓水浴锅达到100℃温度后，取出需要收样的细胞的培养皿或者孔板。

　　2.将缓冲液(1Xloading buffer)置于100℃水浴锅中预热10min。

　　(loding buffer： 是5Xloding buffer用纯水稀释到1Xlodingbuffer。厂家：碧云天;货号： P0015L)

　　3.弃去细胞培养基，用PBS洗两遍。

　　4.取预热好的缓冲液1X loding加ξ入到去除细胞培养液的细胞中，用细胞刮将细胞挂下∮收集到EP管。

　　(加入loding buffer的〓体积建议量，以细胞密度长到70%-80%，6孔板每孔加入120ul;150px皿200ul;250px皿300ul)

　　5.将收集好的细胞液转移到EP管中，立即放入100℃煮15min。

　　6.

　　B

　　1.倒掉ㄨ培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或☉将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶∮底然后再用移液器将其吸走)。

　　2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三◥次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

　　3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF(100 mM)，摇匀置于冰∴上。(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

　　4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解ぷ 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

　　5.裂解完后，用干净的刮棒▓将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然╳后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

　　6.于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。(提前开离心机预冷)

　　7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 min 的离心「管中放于-20℃ 保存。

　　(个人感觉上述方法可操作性有待』加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶 50 ml 的细胞有时※按照实验要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液进行裂解，根本就不够瓶＠ 壁上沾的。本人是先用预冷的 PBS(一般数毫升▅↘)加入后，用细胞刮刮下∏细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到 EP 管中，这样可操作性就比较强)

　　二、组织中总蛋白的提ζ取：

　　1.将少量组织块置于 1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

　　2.加 400 μ 单去污剂裂解液裂(含 PMSF)于匀浆器中进行匀浆。然后︻置于冰上。

　　3.几分钟后再碾一会儿ω　再置于冰上，要重复碾∑几次使组织尽量碾碎。

　　4.裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。

　　三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

　　由于受』药物的影响，一些细胞脱落下△来，所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

　　1.将培养液倒至 15 ml 离心管中，于 2500rpm 离心 5 min。

　　2.弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500rpm 离心 5 min。弃上清后▂用 PBS 重复洗涤一次。

　　3.用枪︾洗干上清后，加 100 μ 裂解液(含 PMSF)冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

　　4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存