蛋白质的分离纯▓化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀←法、有机溶※剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法)、色谱法、离心分】离法等。每类方╲法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀№法,精提就不会用沉淀法。这些方◥法中,应用↓最广的是色谱法。
色谱法,在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中 “chromatography ” 一词翻译成 “ 色谱 ” 。故在此①我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质卐一般也叫填料、固定相。
在蛋白质色谱纯化◣中最重要的是分▓离介质和色谱条件的选※择。有些※从事分离工作的人,拿到样品后常不知道怎么▲办。其实■这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机理来※考虑,就可以自行设计♂分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手〗考虑。
与一般小分子的天然产▼物和合成化合物的分离纯化工作比起来,蛋白质卐的分离有许多特殊性。
1. 蛋白质分︾子的结构决定了其分离工作的方法选择。
蛋白质分子量▅大,都在 6KD 以上,是由多◆个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽ω 链,再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三√级、四级结构的蛋『白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合☆得到结合蛋白,不同的结合蛋白在性◎质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状,其大小因其分子量不同差异很大。故可∞以用排阻色谱、超滤和膜法〖分离大小不同的蛋白质。
蛋白质与氨基◥酸一样,会两性离︻解,在不同的 pH 下形成正离子或负离卐子,蛋白质也有等电点。在相同的 pH 下,不同的蛋白质表面带电情⌒ 况不一样,故︻可以用离子交换色谱分离蛋白质。
蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团,这些疏水侧链在水相中会尽可能↙避开水相而藏于蛋白质分子内部,形成蛋白质分子外部亲水性基团多,疏水性基团多在蛋白质裂隙※内部的情况,在不同条件下蛋白质㊣裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水』基团。在同一个介质①中,不同蛋白质表面的疏水性不同,可以用疏水相互作用♀色谱和反相色谱分离。
生物大分子□ 有一个特性,某些分子或基团对∑ 它们有特异性很强的〗吸附作用。这种作用只针■对一种或一类目标物质。如抗体特异↙性吸附抗原,苯甲脒对】含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会∏有这种特异性吸附作用◤的。
2. 要特别注意保持样品的生物活性。
蛋白质有复』杂的三级、四级结构,热、光和化学品会导致其理化√性质改变和生理活性丧失,这叫失活。失活▃有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体,不溶□于水和溶剂,不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不〓同的复性Ψ 方法恢复其原有的生理活々性。
蛋白质在选择和评价←分离纯化的方法、介质和色谱条件▓时,不仅要注意样品的质量回○收率,还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性,在分离方♂法、填料、色谱◤条件和操作工艺上要注意。
在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色▃谱中,反相色」谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分○析,不太用于制ζ 备;其他→的色谱方法,只要条件选择合〓适,都可以得到高的活性■回收率。
3. 使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。
一般的介○质都是多孔的,多孔介质的比表面∮有 90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面,柱¤容量才能大。所以要根据样品分◥子量选择具有合适的孔的介■质。在排阻色谱中孔的大小用排↘阻极限♂表示;其他㊣ 色谱用分子量适用范围表示,实际是其基质的排阻〗极限。
常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚↓糖系列。琼脂糖的分子量适用范Ψ围取决于制备时琼脂糖的浓度,大家∏熟悉的 4B ,糖的▆浓度是 4% ,适用 6 ×10 4 ~2 × 10 7 分子量; 6B ,糖的浓度∩是 6% ,适用 1 × 10 4 ~4 × 10 6 分子量。葡聚糖Ψ系列的分离范围要看产品说明书,从几千到上千万不◥等。
常用的硅胶系列孔径有用于小分子的 6~12nm ;有用于一定分子量蛋白质的 30 、 50 、 100nm 。
4. 生物大分子有不同于∞小分子的色谱特性。
包括蛋白¤质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。
在梯度㊣ 洗脱的色谱,如反相◤色谱、疏水色谱、离子交换中◢,强洗脱剂的浓度对保留值(容量因子)作【图有明显的突跃。而有机小分子没有①此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。
5 .紫外检测器检测波长固◤定在 280nm 和 220nm 。
280nm 是检测蛋白质中的苯基, 220nm 是检测肽键。蛋白质检【测实际常在选用 280nm 检测波长。
蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式▃;二是选择基质,包括基质的☉种类和排阻极限的选择。
根据目标产品与杂质的性质☆差异选择介◥质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离▓模式。
目标产品与杂质在分子大小、等电点 pI、不失活或可逆失活条件▓下的疏水性、与亲和配基的作用四种性○质上的差异是︻介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的】性质有大的差异,就可用来做△为分离方法选择的依据。目标⌒ 产品与杂质分子大小差异大可用凝■胶色谱分离;等电点pI 差异大可用离子交换色谱【分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱↓分离;与某个亲和配◣基有特异作用的可用亲和色谱分╲离Ψ。
在凝胶◣色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类「色谱中,反︾相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量ξ 分析和氨基酸序列分析,不太用于制∮备;其他『的色谱方法,只要条件选择√合适,都可以得到高的︽活性回收率,可以ㄨ用于制备分离。
基质主要有 3 大类:聚多糖,如交∴联琼脂糖、葡聚糖基√质;硅胶和多孔玻璃;有机◥聚合物(聚苯乙◆烯等)。
由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大〓,用于小分子的小孔填料肯定不能▆用。因为,多孔填料的总的表面积,有 90~95%是在孔内,球型填料的球面上的面◥积只占有 5~10% 。小孔填料的柱容量太▓小。
大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白●质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活性基№团少,制备的∏填料会残留酸性的硅羟基,造成非特异性吸〖附。大孔有机※聚合物疏水性强,与蛋▲白质生物相容性太差,不作亲水♀性处理无法用于蛋白质分离。
交联琼脂∞糖【、葡聚糖基质是最适合用于︻蛋白质分离的基质材料,这两类材料〖生物相容性好,无非特◥异性吸附,表面有大量羟基,可用↑于连接配基,制得各卐种填料。
琼脂√糖微球及其交联后的产品一般叫 4B 、 CL4B 、 4FF 、 6B 、 CL6B 、 6FF,这些产品再键合上不同基团得到离▅子交换、疏水、亲ζ和色谱填料。 4B 、 CL4B 、 4FF 制备时的糖¤浓度为 4% ,排阻极限『为 6 万~2000 万。 6B 、 CL6B 、 6FF 制备时的糖浓▓度为 6% ,排阻╳极限为 1 万 ~400 万。 4B 、 6B 耐压低;CL4B 、 CL6B 耐压㊣ 稍高一点,仍很低; 4FF 、 6FF 耐压较高,使用压力◇可到 0.15 或 0.3MPa 。
葡聚糖♂是线形结构,用环氧氯丙烷交◎联成球。因糖浓←度和交联度不同,得■到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些,在使用时◣不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于↑离子交换、疏水、亲和色谱,较卐多用于凝胶色谱。
西安恒成生物科技有限公司是一家专业从事层╲析介质(色谱填料)研产销一体ω 的公司;
有两︼大类产品:无配基微》球和层析介质
五大层☆析介质都有:离子交换,排阻(凝胶过滤),亲和,疏水,反向;
三类材料:琼脂糖凝●胶,葡聚◣糖凝胶,硅胶
离ω 子交换包括→:阳离子(SP,CM)阴离子(Q,DEAE);
凝胶过¤滤包括:4B,6B,CL-4B,CL-6B,4BFF,6BFF
疏水包括:苯基,丁基
亲和的有:蛋白a柱,去内毒素柱,肝素柱,明胶柱,赖氨酸柱,硼酸柱,ConA柱,镍柱等。
亲和活化中■间体有:溴化*活化4B,氨已基4B,羧已基4B,环氧活化FF,NHS活化等;
反向的有C18,C8,C12 来源:蛋白质的分离纯化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法)、色谱法、离心分离法等。每类方◤法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法,精提就不会用沉淀法。这些方法中,应用最广的是↑色谱法。
色谱法,在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中 “chromatography ” 一词翻译成 “ 色谱 ” 。故在此我▅们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。
在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从⌒事分离工作的人,拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机▂理来考虑,就可以自行设计分卐离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手考虑。
与一般小分子的╲天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来,蛋白质的分离有许多特殊性。
1. 蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。
蛋白质分子量大,都在 6KD 以上,是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成▽肽链,再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成↘有复杂三级、四级结构※的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及〒核酸结合得到结合蛋白,不同的♂结合蛋白在性质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状,其大小因其分子量不同差异很大。故可以用排阻色⊙谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。
蛋白质与氨基酸一样,会两性离解,在不同的 pH 下形成正离↑子或负离子,蛋白质也有等电点。在相同的 pH 下,不同的蛋白质表面带电情况不一样,故可以用离子交换色谱分离※蛋白质。
蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团,这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部,形成蛋白质分子外部亲水性基团多,疏水性基团多在蛋白质裂隙内部ζ 的情况,在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水基团。在同一个介★质中,不同蛋白质表面的疏水性不同,可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。
生物大〓分子有一个特性,某些分子或基卐团对它们有特异性很强的吸附作▂用。这种作用只针对一∑ 种或一类目标物质。如抗体特异性吸附抗★原,苯甲』脒对含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的。
2. 要特别注意保持样品的生物活性。
蛋白→质有复杂的三级、四级结构,热、光和化学品会导致【其理化性质改变和生理活性丧失,这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体,不溶于水和溶¤剂,不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢复其原有的生理】活性。
蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色♂谱条件时,不仅要注意样品♀的质量回收率,还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性,在分离△方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。
在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四〗类色谱中,反相色谱一般』容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分〓析,不太用于制①备;其他的色谱方法,只要条件选←择合适,都可Ψ以得到高的活性回收率。
3. 使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。
一般的ζ 介质都是多孔的,多孔介质的比表面有 90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面,柱容量才能㊣ 大。所以要根据样品分子量选⊙择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的♀大小用排阻极限表示;其他色谱用分子量适用∏范围表示,实际是其基质↓的排阻极限。
常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖←的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度,大家熟悉↙的 4B ,糖的浓◣度是 4% ,适用 6 ×10 4 ~2 × 10 7 分子量; 6B ,糖的浓度是 6% ,适用 1 × 10 4 ~4 × 10 6 分子量。葡聚糖系列的分离范围要ζ 看产品说明书,从几千到上ω千万不等。
常用的硅胶系列孔径有用于小分子的 6~12nm ;有用于一定分子量蛋白质的 30 、 50 、 100nm 。
4. 生物大分子▲有不同于小分子的色谱特性。
包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。
在〓梯度洗脱的色谱,如〗反相色谱、疏水色谱、离子交换中,强洗脱剂的浓度对保留值(容量因子)作图有明显的突跃。而有机小分子没有此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。
5 .紫外检测器检测波长△固定在 280nm 和 220nm 。
280nm 是检测蛋白质中的苯基, 220nm 是检测肽键。蛋白质①检测实际常在选用 280nm 检测波长。
蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式;二是选择基质,包□括基质的种类和排阻极限的选择。
根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就◇是选择了分离模式。
目标产品与杂质在分子大小、等电点 pI、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基♀的作用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异,就可用来做为←分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用凝胶色谱分离;等电点pI 差异大可用离子交换色谱分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离;与某个亲和配基有特异作用的可用」亲和色谱分离。
在凝√胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类︽色谱中,反相色◆谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性ω 回收率,可以用于制备分※离。
基质主要有 3 大类:聚多糖,如交↓联琼脂糖、葡聚糖基质;硅胶和多孔玻璃;有机聚合物(聚苯乙烯◤等№)。
由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大,用于小分子的小孔填料肯定↑不能用。因为,多孔填料的总的表面积,有 90~95%是在孔内,球型填料的球面上ξ 的面积只占有 5~10% 。小孔填料的柱容◣量太小。
大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活ㄨ性基团少,制备的填㊣料会残留酸性的硅羟基,造成非特异卐性吸附。大※孔有机聚合物疏水性强,与蛋白质生物相容●性太差,不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。
交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料,这两类材料生物相容性好,无非特异性吸附,表面有大量羟基,可用于连接配基∞,制得各种填料。
琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫 4B 、 CL4B 、 4FF 、 6B 、 CL6B 、 6FF,这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。 4B 、 CL4B 、 4FF 制备时的『糖浓度为 4% ,排阻极※限为 6 万~2000 万。 6B 、 CL6B 、 6FF 制备时的糖浓度为 6% ,排阻◇极限为 1 万 ~400 万。 4B 、 6B 耐压低;CL4B 、 CL6B 耐压稍高一□点,仍很低; 4FF 、 6FF 耐压较高,使用压力☆可到 0.15 或 0.3MPa 。
葡聚糖是①线形结构,用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同,得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于〗凝胶色谱。
西安恒成生物科技有限公司是一家专业从事层析介质(色谱填料)研产销一∑ 体的公司;
有两大类产品:无配基微球和□ 层析介质
五大层』析介质都有:离子交换,排阻(凝胶过滤),亲和,疏水,反向;
三类材料:琼脂糖凝胶,葡聚糖凝胶ξ ,硅胶
离子交换①包括:阳离子(SP,CM)阴离子(Q,DEAE);
凝胶过滤包括:4B,6B,CL-4B,CL-6B,4BFF,6BFF
疏水包括:苯基,丁基
亲和的有:蛋白a柱,去内毒素柱,肝素柱,明胶柱,赖氨酸柱,硼酸柱,ConA柱,镍柱等。
亲和活化中间Ψ 体有:溴化*活化4B,氨已基4B,羧已基4B,环氧活化FF,NHS活化等;
反向的有C18,C8,C12来源:蛋白质的分离纯化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法)、色谱法、离心分离法等。每类方法有其自己的特点和适》用范围。如粗提常用沉淀法,精提就不会用沉淀法。这些方法中,应用最◆广的是色谱法。
色谱法,在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中 “chromatography ” 一词翻译成 “ 色谱 ” 。故在⊙此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。
在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工作的人,拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的╱分离机理来考虑,就可以自行设〗计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手考虑。
与一般》小分子的天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来,蛋白质的分离有许多特殊性。
1. 蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。
蛋白质分子量大,都在 6KD 以上,是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合」成肽链,再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三级、四级结构的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白,不同的结合蛋◇白在性质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状,其大小因其分子量不同差异很大。故◢可以用排阻色谱㊣ 、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。
蛋白质与氨基酸一样,会两性离解,在不同的 pH 下形成正离子或负离子,蛋白质也有等电点。在相同的 pH 下,不同的蛋白质表面带电情况不一样,故可以用离子交ω 换色谱分离蛋白质。
蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团,这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部,形成蛋白质分子外部亲水性基团多,疏水性基团多在蛋∞白质裂隙内部的情况,在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水基团。在同一个介╳质中,不同蛋白质表面的疏水性不同,可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。
生物大分子有一个特性,某些∏分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种作用只针对一种或一类目标物质。如抗体特异性吸附ξ抗原,苯甲脒对含丝氨酸的蛋白质有ㄨ吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的。
2. 要特别注意保持样品的生物活性。
蛋白质有复杂的三级、四级结构,热、光和化学◥品会导致其理化性质改变和生理活性丧失,这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体,不溶于水和溶剂,不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢复其原有的○生理活性。
蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时,不仅要注意样品的质※量回收率,还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性,在分●离方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。
在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱①中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率。
3. 使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。
一般∞的介质都是多孔的,多孔介质的比表面有 90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面,柱容量才能大。所以要根据样品∏分子量选择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示;其他色谱用分『子量适用范围表示,实际是其基质的排阻极限。
常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度,大家熟悉的 4B ,糖的浓度是 4% ,适用 6 ×10 4 ~2 × 10 7 分子量; 6B ,糖的浓度是 6% ,适用 1 × 10 4 ~4 × 10 6 分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品说明书,从几千到上千万不等。
常用的硅胶系列孔径有用于小分子的 6~12nm ;有用于一定分子量蛋白质的 30 、 50 、 100nm 。
4. 生物大分子有不同于小分子的色谱特性。
包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。
在梯度洗脱的色谱,如反∴相色谱、疏水色谱、离子交换中,强洗脱剂的浓度对保留值(容量因子)作图有明显的突跃。而有机小分子没有此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。
5 .紫外检∴测器检测波长固定在 280nm 和 220nm 。
280nm 是检测蛋白质中的苯基, 220nm 是检测肽键。蛋白质检测实际常在选用 280nm 检测波长。
蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式;二是选择基质,包括基▆质的种类和排阻极限的选择。
根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离模式。
目标产品与杂质在分子大小、等电点 pI、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基的作〓用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异,就可【用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用凝胶色谱分离;等电点pI 差异大可用离子交换色谱分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离;与某个亲和配基有特异作用的可用亲和色谱分离。
在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率,可以用于制备分离。
基质主要有 3 大类:聚多糖,如交联琼脂糖、葡聚糖基质;硅胶和多孔玻璃;有机聚合物(聚苯乙烯等)。
由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大,用于小分子的小孔填料肯定不能用。因为,多孔填料的总的表面积,有 90~95%是在孔内,球型填料的球面上的面积只占有 5~10% 。小孔填料的№柱容量太小。
大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活性▅基团少,制备的填料会残留酸性的硅羟基,造成非特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强,与蛋白质生物相容性太差,不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。
交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料,这两类材料生物相容性好,无非特异性吸附,表面有大量羟基,可用于连接配基,制得各种填料。
琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫 4B 、 CL4B 、 4FF 、 6B 、 CL6B 、 6FF,这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。 4B 、 CL4B 、 4FF 制备时的糖浓度为 4% ,排阻极限为 6 万~2000 万。 6B 、 CL6B 、 6FF 制备时的糖浓度为 6% ,排阻极限为 1 万 ~400 万。 4B 、 6B 耐压低;CL4B 、 CL6B 耐压稍高一点,仍很低; 4FF 、 6FF 耐压较高,使用〒压力可到 0.15 或 0.3MPa 。
葡聚糖是线形结构,用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同,得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于凝胶色谱。
西安恒成生物科技有限公司是一家专业从事层析介质(色谱填料)研产销一体的公司;
有两大类产品:无配基微球和层析介质
五大↑层析介质都有:离子交换,排阻(凝胶过滤),亲和,疏水,反向;
三类材料:琼脂糖凝胶,葡聚糖凝胶,硅胶
离子交换包括:阳离子(SP,CM)阴离子(Q,DEAE);
凝胶过滤包括:4B,6B,CL-4B,CL-6B,4BFF,6BFF
疏水包括:苯基,丁基
亲和的有:蛋白a柱,去内毒素柱,肝素柱,明胶柱,赖氨酸柱,硼酸柱,ConA柱,镍柱等。
亲和活⌒化中间体有:溴化*活化4B,氨已基4B,羧已基4B,环氧活化FF,NHS活化等;
反向的有C18,C8,C12
来源:西安恒成生物科技有限公司