一．细胞培养技术细胞周期的测定一、原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周↑期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体♀上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅∩经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂≡相中各期比例，就可算出细胞周期的值。二、仪器、用品与试剂1、仪器、用品：同常规细胞培养2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液三、操作步骤1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终☆浓度为10μg/ml。2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。4、常规染色体制片（见第三部分◥：染色体技术）。5、染色体玻№片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。6、弃去2×SSC液，流水冲洗。7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。9、计算： 细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸↓三钠⌒•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。细胞的冻存和复苏一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压√改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时★速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力『受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿ξ透细胞。二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培∮养，计数，调整至5×106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口◤一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明ζ　细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻〓室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检Ψ查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液◥氮能用1～1.5月。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻▓存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将↑细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用「冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护←剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。细胞系或细胞株的建立一、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培▅养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特∏殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个ζ培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续◆传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半∞年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。二、建立︻细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群ω　可被认可为己鉴定的细胞，视具体情∑况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织』种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做▲如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的※器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断▃，以及病︾历号等