一、材料与试剂1. 第一抗体2. 第二抗体（Invitrogen）3. 100%冰冷丙酮4. 马血清（SantaCruz;sc-2483）5. Hoechst 33342荧光染料（Invitrogen;H1399）6. ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen;P36934）7. 免疫组化笔（Sigma;Z377821）8. 指甲油（FisherScientific;50-949-071）9. PBS10. 甲醛11. 甲醇12. TritonX-100 二、仪器1. -20°C冰箱2. 湿盒 三、步骤1. 从冷藏室取出7 μm 的冻干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分钟。注，可选的固定条件依赖于所使用的抗原及一抗。常用的固定剂有甲醛、丙酮及甲醇。2. 用PBS洗涤载片后吸干组织周围的水份，使载〓片干燥。小心地用PAP笔绕组织圈出轮廓。3. 将切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的马血清溶液在室温下封闭1小时。4. 吸▲干封闭缓冲液，切片放入湿盒中与含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释的第一抗室温体孵育1小时。用足量的抗体溶液完全浸没切片，约150微升。提示,按照推荐方法稀释抗体。5. 吸去第一抗体并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗↑涤5次。6. 切片在湿盒中与相应的第二荧光抗体AlexaFluor488/555antibody（MolecularProbes）室温孵育1小时。二抗用含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释，比例为1：300，用足够量的二々抗溶液（约150 μl）以完全浸没切片。7. 吸去二抗∞并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤2次。8. 用150 μl 的PBS缓冲液洗涤切片3次。9. 将切片与Hoechst 33342核染料[2 mg/ml 溶于PBS中]孵育2分钟。10. 吸去二抗并用150 μl 的PBS缓冲液洗涤3次。11. 让切☆片干后，每个切片中加约2滴的ProLongGold抗褪色试剂，盖上盖玻片。注意，要小心避免太过滑动盖玻片而损坏组织，不要造成气泡。吸去多余的试剂。12. 避光放置在室温下几个小时或过液让切片干燥。一旦载片完全变干，用干净的指甲油封住盖玻片的边沿。封片可以避光存放于-20°C几周时间。