免疫『组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。
免疫组织化学技术按照标记物的种类●可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代 生物 学和医学中广泛应用的方法≡之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以＠及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫卐荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存□等缺点，在普及应用○上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
一、免疫荧光法
免疫荧光法的基本原理♀是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合ㄨ物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看ξ 见发出荧光的抗原抗体结合部︾位，检测出抗原或抗体。常用的荧∮光素有①异硫氰酸荧光素(fluorecein isothiocyante，FITC)，为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389，最大吸收光◥谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的黄绿色荧光，是最常用的◣标记抗体的荧光素。②四甲基异氰酸罗达明(tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC)是※一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明(rhodamine)的衍 生物 。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn呈橙≡红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。
按照抗原抗↘体反应的结合步聚ぷ，免疫荧光法可分为①以下三种。
1.直接法
用荧光素标记的特异性▆抗体直接与相╳应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。
2.间接法
先用特异性抗体与相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体(间接荧光抗体》)与特异性♀抗体相结合，形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物』。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏。
3.补体法
用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗体复合物№上，再用抗补体的荧光抗体与之相结合，就形成了抗原一抗体一补体一抗补体荧光抗体的⌒ 复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的▃部分即是№抗原所在的部位。补体法具有敏感性强的优势，同时适用于各种不同种∏属来源的特异性抗体的标记显示，在各种不同种属动物抗体的检测上为最常用的技术方法。
4.双重免疫荧╱光法
在对同一组织细胞标本上需要检测两种抗原时，可进行双重荧光染色，即将两▽种特异性抗体(例如抗A和抗B)分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，抗A抗体用异※硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗明达标记发出橙红♂色荧光，将两将荧光抗体按适¤当比例混合后，加在标本上(直接法)就分别〗形成抗原抗体复合物，发出黄绿色荧ζ 光的即抗A抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B抗体结∑合的部位，这样就明确显示两种抗原的定位。
二、免疫酶法
免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原(或抗体)的新技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。已如前述，免疫荧『光法具有操作简便、灵敏、特异性高、省时的优势，但同时也具有令人遗憾的不足，特别是荧光标本不能长期保存以△及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。为此，Nakane等人(1966)尝试了用酶代替荧光々素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法)。Sternbenger等人又将非标记抗体过氧化物〓酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的进步，成为当今使用最为广泛的免▂疫组织化学技术。
免疫酶法与免疫荧光法相比较，具有以◤下优点：酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通 生物显微镜 下观察，而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察(免疫电镜技术)，光镜与电镜的结〓合，使灵♂敏度进一步提高，标本⊙又能长期保存，并能加设HE染色等其々他复染，有利于将被检测物质与病变的●形态学改□变联系起来(定性与定位)，弥补了免疫荧光法的不足。
免疫酶法的基本原←理与免疫荧光法有所相似，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成◥酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化◣作用，生成有←色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。
从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗╲体进行免疫酶法染色，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不【多。sternbenger等人指出：用于标记的酶应具备以下六点：
1.酶催化◥的底物必需是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易→于在光镜和电镜下观察。
2.酶反〒应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。
3.较易获得纯的酶分子。
4.中性PH值时，酶分子应稳≡定。
5.在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响二者的活性。
6.被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。
上卐述六点中以1.2两点最为重要，因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复√合物。符合上述要求的，最为常用的酶是『辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，H：：flJ)。其次是碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)，除此两种外，还有葡萄糖氧◆化酶(Glucose oxidase，GOD)等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。
