1.把将被染色分析的细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液(binding buffer)中以1 x 106 细胞/mL的浓度重悬。(染色缓冲液，binding buffer,中必须含有钙离子)

　　2.吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。(必须在室温下进行)

　　3.加入适量的荧光标记的annexin V试剂和PI。(必须在室温下进行)

　　4.混匀后避光室温下孵育15分钟。(必须在室温下进行)

　　5. 孵育◎后加入400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。(实验必须在一小时内完成，否则无意义!)

　　我们推荐另外制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门∮的范围：

　　a) 没有染色∩的细胞;

　　b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;

　　c) 仅用PI染色的细胞.

　　annexin V和PI双阳性可以说明细胞群体中含有死亡细胞。我们推荐可以使用一个细胞系来制备以上三个对照管来作为annexin V和PI阳性染色对照。可以使用在RPMI +10% FCS + 2-4 ng/mL的TNF-a孵育2-3小时的人U-937细胞，或在培养液中孵育◤1-2小时鼠淋巴◢细胞作为对照细胞。

　　请依据以下建议来正确设置仪器补偿。以下方案可以根据不同①的细胞类型稍加修改。

　　在流式细胞仪上分析经染色的细胞:

　　使用流式细胞仪正确分析annexin V-FITC和PI双标的细胞要求仪器的荧□　光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因╳为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的◣补偿不同。我们建议在实验开始阶段分析单染◤的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。

　　1. 上样未经染色→的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。

　　注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变ㄨ的细胞。

　　2.建立LogFL1-LogFL2双参数点图并分析以上光散射图中→设门的细胞;保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限≡中心区域。

　　3. 检测annexin V-FITC单染的细胞并检查『FL1-FL2散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出】现在上端象限则说明有荧光∏渗漏;此时FL1的荧光被FL2 PMT检测到了。为了纠正这↙种现象，增加FL1漏到FL2荧光的补偿%(这可能在1-5%之间)。如果这个调〇节没有有效地去除FL2的阳●性信号，此时要降低FL2 PMT的电压。

　　4. 检测PI单染的细胞并检查FL1-FL2散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏;此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL2漏到FL1荧光的补偿%(这可能在15-25%之间)。如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。

　　5. 如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，我们建议重复▓3、4步骤，确保不∑引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细＠胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。

　　6.因为许多未处理的细胞群体中存在一定数量的annexin V和PI双阳性∮的细胞，运用annexin V试剂盒来检测凋亡必须从处理过的细胞中扣除这些原本就存在♀的双阳性细胞。

　　7.根据未处理细胞或对照细胞经annexin V和PI染色后在流式细胞上分析的结果来设定十字ㄨ门的位置，FL1和FL2的划定方法如下：

　　a. 设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是annexin V染色阴性∮的细胞(一般这些细胞会↓在FL1轴方向上升至2个对数坐标值)。将垂直的FL1标尺设定♀在紧靠annexin V阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。

　　b. 设定FL2标尺位置: 可以通过◥一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方(ANN+/PI-)还有≡就是右上方(ANN+/PI+)。水平线可以置于这两∞群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞ぷ群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。理想中，以上介绍╳的设门方法可以适用于任何细胞群体来设定十字门的位ξ　置。

　　8. 经处理过的细☉胞此时可以用annexin V 和PI染色后在流式细胞仪上分析。那些在》在阴性群体门以外的细胞可被识为annexin V或annexin V和PI阳性的细胞。

　　注意：建议细胞经染色尽快分析。尽管此处没有推荐使∩用经1%甲醛固定的细胞，但它◥在某些实验中可用它作为annexin V和PI双染阳性对照使用。制备以上对照可将细胞№重悬在1X的染色※缓冲液和固定剂混合液中。然而这个步骤会明显地降低annexin V和PI的染色荧⌒　光强度。