今日技术解∴析流式细⊙胞仪实验方法

　　一、实验准备

　　1. 标本制备：

　　2. 最小化非特异性结合：

　　二、凋亡

　　1.凋亡的检测方法：网站和其它

　　2.PI染色法

　　3.Annexin V 法

　　4.TUNNEL法

　　三、细胞因子

　　1.激活的细胞因子

　　2.CBA

　　四、血小板

　　1.活化

　　2.活化检测

　　3.网织血小板

　　五、红细胞

　　1.网织红细胞

　　2.PNH

　　3.胎儿红细胞

　　六、肿瘤学

　　1.DNA 细胞周期

　　2.蛋白

　　3.多药耐药

　　4.微小残留∑　白血病

　　第一部分标本处理

　　一、流式细胞术常规检测时的样品制备

　　(一)直接免疫荧光标记法

　　取一定量细胞(约1X106细胞/ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接√有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次，加入缓冲∑　液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

　　(二)间接免疫荧光标记法

　　取一定量的细胞ζ悬液(约1X106细胞/ml)，先加入特异的第¤一抗体，待反应完全后★洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗〖抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激＠发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非ξ特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时●应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤ω　较多，增加了细々胞的丢失，不适〖用测定细胞数较少的标本。

　　二、最小化非特异性结合的方法

　　1.荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

　　2.在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛※血清蛋白(BSA)，脱脂干奶酪☉，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一○抗体和细胞表面或胞内结♀构的非特异性的交互作用来降低背景。

　　3.在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗Ψ体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。

　　通过用来自【于同样的样品的血清稀释□标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很∴多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。

　　4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合」。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容【易利用。而第一抗体的F(ab’)2片◤段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。

　　5.其它：已标记的抗「体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景▆，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

　　第二部分细胞因子

　　细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

　　一、简介

　　随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子△在疾病中的作用越来越显的重要无比▆。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis，LDA)和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检ζ测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强□　度大，难以进』行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

　　早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激ζ活。尽管◆研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因⌒　子的合成，如TH1(IL-2，IFN-g)与TH2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很ω　难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能◎相关性还未被揭示。

　　近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细◆胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释ζ　放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检∮测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因卐子。

　　胞内流式︾分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

　　? 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便;

　　? 简便：无需组织培养，可以全血◥分析，无需分离PBMCs;

　　? 灵敏度高：高度灵敏的荧光▲标记与检测系统;

　　? 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析;

　　? 安全：减少样本处理与生物源性污染

　　? 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

　　二、所需仪器

　　1.流式上▂样管及细胞培养皿或板

　　2.25%CO2，37℃孵箱

　　3. 混匀振荡器

　　4.离心机

　　5.加样器、Tips

　　6.流式细胞仪

　　三、常用的标本类型和处理方法

　　全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

　　自身血浆中外△周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

　　组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细々胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。

　　细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。

　　冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

　　四、所需试剂

　　1、细胞表面染色的荧光标记的】单抗试剂

　　依据实验需要选←择特殊表面标志

　　CD45圈定所有淋巴细胞

　　CD3 圈定T淋巴细胞

　　CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群

　　CD8 圈定T抑制№淋巴细胞亚群

　　CD19/或CD20圈定B淋巴细胞

　　CD56圈定NK淋巴细胞

　　CD14圈定单核细胞

　　2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体

　　3、溶血素：用外周全血检〓测时需使用溶血素(R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠;eBioscience目录号00-4333)溶解红细胞

　　4、激活剂

　　①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Alexis，目录号ALX-445-004-M001)

　　A.DMSO中【调节浓度0.1mg/mL

　　B.分装(20mL)，-20℃储存。勿反复冻融

　　C.每次实验用无菌无↓叠氮钠PBS 1：100稀释储◆存液

　　D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液

　　②Ionomycin (Alexis,目录号ALX-450-006-M001)

　　A.于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL

　　B.-20℃储存

　　C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

　　D.Ionomycin终浓度1mg/mL细胞悬液

　　③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)

　　A.无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL

　　B.4℃储存

　　C.SEB终浓度10mg/mL细胞悬液

　　④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞

　　⑤CD28：加速不◆同刺激剂(包括SEB、CD3等)的活化效应，浓度︼一般为10ug/ml

　　5、阻断剂

　　阻↓断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内

　　① Brefeldin-A(BFA) (eBioscience，目录号00-4506)

　　A. 于DMSO中调节浓』度5mg/mL

　　B. 分装(20mL)，-20℃储存。勿反复冻融。

　　C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

　　D. 激活最后4-5小时BFA终浓度10mg/mL细胞悬液。

　　注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降

　　② Monensin (eBioscience，目录号00-4505)

　　6、不含谷氨酰胺的RPMI-1640

　　7、固定剂：细∮胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白√的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多★聚甲醛PBS溶液(eBioscience，目录号00-8222)

　　8、破膜剂：含1%皂甙、0.05%叠√氮化钠的Hanks溶液(HBBS)(eBioscience，目录号00-8333)

　　将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合

　　9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

　　五、细胞培养和刺激的基本方法

　　细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和▃刺激时间，以获得最佳◥的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。

　　表1、细胞∮内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法

　　为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)

　　方法1: 只使用转染细胞检测

　　方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.

　　方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.

　　方法4: 人的PBMCs或者纯╱化的CD4+细胞在包被人CD3抗ㄨ体的培养№板中，使用含有重组◥人的IL-2(10 ng/ml，目录号202-IL-010)和IL-4(10 ng/ml，目录号204-IL-005)的培养基培养∞两天;细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天;最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时

　　方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days

　　方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)

　　方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激

　　方法8: PBMCs细胞使用重组人①IFNg (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFNg (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.

　　方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时

　　方法10: CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠◥的IL-2(10 ng/ml，目录号402-ML-020)和IL-4(50 ng/ml，目录号404-ML-005)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。

　　方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时

　　方法12: 小鼠∏脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时