细胞技术血细胞的离心分离_教育装备采↑购网

在现代临床医学研究中，常常需要将全血中单核白细胞(淋巴细胞、大单核细胞)与红细胞和多形核白细胞分离。在临床治疗应用中常常需要将全血作成分分离(全血分离成血浆，血小板，白细胞，红细胞等等)

　　(一)血细胞的实验室纯化：

　　血液中存在着各种不同类型的血细胞，每种类型细胞有不同的特点和功能。医学研究常常需要较纯的单一品种的血细胞。用离心法分离和纯化是非常有效的手段，但如何使血细胞的密度梯度分离简单而且实用，很多科学家和○试剂生产厂作了大量的研究和筛选。在这方面Bφyum(文献1)做了开拓性的研究，他使用挪威Nycomed pharma，A/S公司生产的梯度材料Lymphoprep 和由瑞典Pharmacia-Biosystems AB 公司提供的Ficoll Paque，用简单的低速阶梯梯度离心纯化了单核白细胞获得成功。此后(文献2)，用非电离性梯◣度材料Na-metrigoate 和Nycodenz(可消除多糖成分)纯化血细胞效果更好。

　　典型的离心分离实验：

　　1. 人血单核细胞的纯化：

　　Ⅰ 加有抗凝剂的全血样品，通常加0.32%柠檬酸钠较为普遍;

　　Ⅱ 用等量的等渗盐液稀释全血

　　Ⅲ 在10-15ml离心管下部注入3ml Na-metrizoate-Ficoll分离液

　　Ⅳ 在分离液上部小心地铺盖6ml已经稀≡释的全血

　　Ⅴ 低速离心机，水平转头，单管容量10-15ml，600xg，20分钟，20℃，慢加速，慢减速。(不要用4-5℃，否则效果很差)

　　Ⅵ 离心后，单核细胞和少量血小板悬浮在血液样品和分离液的中向夹层，小心地用吸管吸出

　　Ⅶ 在单核细胞中加几毫升▆生理盐水以降低其密度

　　Ⅷ 用同样的离心机250xg，5分钟，20℃“洗”数次，可以得到更纯的单核细胞沉淀

　　Ⅸ 制备的细胞可重悬浮在生理盐水或同源血浆中待用

　　2. 单核血细胞和多形核血细胞的单次离心分离法：

　　Ⅰ 刚抽出的新鲜人血，加抗凝剂后，取3-5ml铺在10ml离心管底部

　　Ⅱ 血样上部铺等量的Polymorphoprep(Nycomed Pharma A/S公司产品)

　　(注意：选择较细长透明塑料(PC或PET)离心管或玻璃离心管，液柱总高在6-10mm左右)

　　Ⅲ 离心：低速或高速冷冻离心机水平转头450g×35分钟，20℃

　　Ⅳ 离心后ω　细胞分布：以10cm液柱为例，底部1.2-1.4cm为红细胞，往上3cm为分离液，再往上0.4cm为中性白细胞带(多形核白细胞)，再往上0.6-0.8cm为分离液，在这层分离液和最上层血浆之间夹有一层约0.4cm液柱高的单核细胞

　　Ⅴ 如果离心时间过长，或温度过高，多形核白细胞(主要是中性白细胞)也会变成沉淀

　　常用的商品化的分离介质：

介质商品名称	成分	分离对象	供应商
Lymphoprep	9.6%(w/v) Na-metrigoate 5.6%(w/v)Ficoll	单核白细胞	Nycomed-pharma
Ficoll-paque	9.6%(w/v) Na-diatrigoate 5.6%(w/v)Ficoll	同上	Pharmacia-Biosysstems
Nycoprep1.077	14.1%(w/v)Nycodenz 0.44%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep mixer	19.0%(w/v)Nycodenz 0.290%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.068	13.0%(w/v)Nycodenz 0.58%(w/v)Nacl	同上	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.063	12%(w/v)Nycodenz 0.56%(w/v)Nacl	单核细胞	Nycomed-pharma
Mono-poly resolving medium	15.5%(w/v) Na-diatrizoate 8.18%(w/v)Ficoll	多形核细胞	Flow Laboratories
Polymorphoprep	13.8%(w/v) Na-diatrizoate 8.0%(w/v)Dextran 500	多形核细胞	Nycomed-pharma