一、原理
1、E .coli 表达系统
E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其≡在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达■
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源♀基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料
1、诱导表达材料
(1 )LB (Luria—Bertani))培养基
酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g
NaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%
蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
(2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤▅除菌，分装成1 ml /份，-20 ℃ 保存。
(3 )l× 凝胶电泳加↑样缓冲液：
50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS (电泳级)
0.1 % 溴酚蓝
10 % 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 )酶溶法
(1)裂解缓冲⊙液：
50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。
(3)10 mg / ml 溶菌酶。
(4)脱氧胆酸。
(5)1 mg / ml DNase I。
2 )超声破碎法
(1 )TE 缓冲液。
(2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓ζ 冲液：
100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚蓝
20 % 甘油
三、实验方案
1、外源基因的诱导表达
(1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目∞的基因。
(2 )按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌♀。
(3 )筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，
确定无误后进行下一步。
(4 )如果表达载体的原核≡启动子为→PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培♀养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓△度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
(5 )取上述培养液1 ml ,1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液Ψ后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离←与蛋白质纯化
1 )细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗︽透等。前三种方⊙法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用【较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显＠著。主要步骤为：
① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的¤细菌培养液(100 ml )。弃上清，约每ω克湿菌加3 ml 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ;边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸(在冷室中进行)。
③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放◣置至溶液不再粘稠。
(2 )超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行☆细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体◣的粘稠度。
① 收集1 L 诱导表达的∩工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ;弃上清，约每〒克湿菌加3 mlTE 缓冲液。
② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌;10 000g 离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。
③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶▃电泳加样缓冲液，进行SDS -PAGE 。
注意事项：超声破碎与声∞频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等↘因素有关，应根据★具体情况掌握;超声波破菌ω 前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
2 )包涵体的分离
蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成〇相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可※用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。
(1)试剂与配▲制
① 洗涤液I：
0.5 % Triton X -100
10 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )
溶于细胞裂解液中。
② 2×凝★胶电泳加样缓冲液。
(2)细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min ,4 ℃ ;弃上清，沉淀用9× 洗涤液l 悬浮;室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min ,4 ℃ ;吸出上清，用100 μL 水重新悬】浮沉淀;分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE 。
3 )包涵体的溶解和复性
(1)试剂与配制
① 缓冲液I：
1 mmol / L PMSF
8mol /L 尿素
10 mmol / L DTT
溶于前述裂解缓冲液中。
② 缓冲液Ⅱ：
50 mmol / L KH2PO4
1 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )
50 mmol / L NaCI
2 mmol / L 还原」型谷胱甘肽
1 mmol / L 氧化型谷胱甘∞肽
③ KOH 和HCI 。
④ 2×凝胶电泳加样缓冲液。
(2)用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体;室温放置lh ;加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ;用HCI 调至pH 8 .0 ，在室温放置至少30 min ; 1000g 离心，15 min ，室温;吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝胶∑ 电泳加样缓冲液溶解沉淀;取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。
四、注意事项
(1)不同的█大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。
(2)表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导△细胞。
(3)由于大肠杆菌中◇表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。
