PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链;(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模「板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
一、 PCR反应中的主要成份
1、引物：PCR反应产物的特异性由一对】上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计⊙和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约№为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基ω 应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样易导致错╳误引发。(4) 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密』码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内， 尤其在3端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5端对扩增√特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体★结合位点、起始密码子、缺失或插入突变♀位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3端︾应不存在简并性。否则可能由于◆产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反★应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配≡成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反︾应中每种dNTP的∮终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3、 Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响〇酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度」， 影响产物的特异性以及≡引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一▲种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能△影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
4、 模板：PCR反应必ㄨ须以DNA为模板进行█扩增， 模板DNA可以是单链←分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人←基因组＠DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大⊙肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的〒DNA中分析目的序列【。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5、 Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min， 97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的〖活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义＠为74℃下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错ξ 率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行←序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶〒就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低.反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭¤活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯＠ 化PCR产物的Kit可用。
6、反应→缓冲液：反应缓冲▲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基∴因32蛋白则对扩◣增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二、PCR反应参数
1、变性：在第︼一轮循环前，在94℃下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍◆有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完》全，所耗时间主要是为√使反应体系完全达到适当↘的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶Ψ 活性的损失。
2、退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使■用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当※引物中GC含量高，长度长〇并与模板完全配对时， 应提高退火温度。退火温度越▃高， 所得产物的特◥异性越高。有些反应▲甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环， 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃，1-2min。
3、延伸：延伸反应↑通常为72℃，接近于Taq DNA聚合■酶的最适反应温度75℃。实际上，引物▃延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于∞目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目】的序列， 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完▲成后，都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的№产物， 这对以」后进行克隆或测序反应尤为重要。
4、循环次数： 当其它参数确定之々后， 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后， 反应中Taq DNA聚合酶已经不足， 如果此时产物量仍不够， 需要进一⊙步扩增， 可将扩增ξ 的DNA样品稀释103-105倍作为模板， 重新加入各种反应底物进行扩增， 这样经60轮循环后， 扩增水Ψ平可达109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示：C=C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量，C0 为起始DNA量， P为增效率， n为循环次数。
在扩〗增后期，由于产◎物积累，使原来呈指数『扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台︽期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续⊙大量扩增，达到较◇高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。
三、PCR产物的克隆
在许多研究中，需要将PCR产物克隆，以获得目的DNA片段。此时，所用PCR循环数应尽〓量小，以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物︼插入到载体中有下列一些方法。
1、 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模板依∩赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。
2、在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产◤物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点〓，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进◣行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP，ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键，保证在载体3端只加上一个ddTTP，而其5端所含的磷酸基团可与PCR产物的3端OH连接，连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口，这种重组DNA仍可转化合适的受体菌，并在细↑菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于◣克隆PCR产物的带3-T的T-Vector。
3、粘性末端连◢接：利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的ζ限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。
材料、设备〇及试剂
一、材料
不同来源的ㄨ模板DNA。
二、设备
移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳╱所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。
三、试剂：
1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.0， 1.0% Triton X-100。
2、MgCl2 ：25mmol/L。
3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
5、T4 DNA连接酶及连接缓↘冲液。
6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
7、其它试剂：矿物油(石蜡油)，1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70% 乙醇。
操作步骤
一、PCR反应
1、 依次混匀下列试剂
35μl H2 O
5μl 10×PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种dNTP
0.5μl 上游引物(引物1)
0.5μl 下游引物(引物2)
0.5μl 模板DNA(约1ng)
混匀后离心5秒。
2、将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀▂后稍离心卐，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3、 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮→循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10μl扩增产物用※1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连＠接，往往需→要将产物纯化∏。
(一)酚/氯仿法
1、取反应产物加100μl TE.。
2、加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸↙至新的小管中. 这样抽▃提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
3、再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
4、在水相中加300μl 95%乙醇，置-20℃下30min沉淀。
5、在小离心机上10000rpm离心10min，吸净上清液。加入1ml 70%乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀⌒溶于7ml ddH2O 中，待用。
(二)Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系ξ统可以快速、有效、可靠地提取↙PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于」测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：
50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
5ml 直接提取♀缓冲液
50支 Wizard微型柱
1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
4、取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪№将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推ξ ，使混合物进入微型柱。
5、将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
6、取出微型柱置于eppendorf管中，12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。
8、丢弃↓微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
[注意]
1、纯化树脂在使用前◣必须充分混匀。
2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
四、载体加dT尾
1、将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2、在小□管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。
3、加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。
4、按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5、加入2倍体积 95%乙醇，在-20℃下沉淀1hr。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与∮载体粘末端连接
1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。
2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓∮中液，混匀，16℃连接过夜。
3、取5ml连接产物↓转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3突出端切平及平末端连接
1、 在50ml的PCR产物中，直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混①匀。
2、 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3、 用酚:氯仿抽提2次。
4、乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
5、 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭︼活酶，取1ml (约0.1mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。
6、取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
[注意]
1、PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2、吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
3、加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂☉及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4、应设∞含除模板DNA所有其它成分的负对照。
