材料、设备及试剂

　　一、材料

　　不同来↓源的模板DNA。

　　二、设备

　　移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，台式高速离心机。

　　三、试剂：

　　1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris?Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。

　　2、MgCl2 ：25mmol/L。

　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。

　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。

　　操作步骤

　　一、PCR反应

　　1. 依次混匀下列试剂

　　35μl H2 O

　　5μl 10×PCR反应缓冲液

　　4μl 25mmol/L MgCl2

　　4μl 4种dNTP

　　0.5μl 上游引物(引物1)

　　0.5μl 下游引物(引物2)

　　0.5μl 模板DNA(约1ng)

　　混匀后离心5秒。

　　2. 将混合物在94℃下加热5分钟后』冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心,加★入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

　　3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

　　二、电泳

　　取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

　　[注意]

　　1.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头∞用毕应更换, 不要互相污染试剂。

　　2.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

　　3.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。