PCR技术可↘用于：(1)检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态;(2)有效检测癌基因的】突变，准确检测癌基因的表达量;(3)临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

　　实验方法原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制ξ过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷∞酸引物。

　　PCR由变性--退火--延伸三个基¤本反应步骤构成：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经◤加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模ξ　板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物■结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对◥与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

　　重□复循环变性--退火--延伸三过◇程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　一、PCR反应的关键①环节

　　1. 模板核▓酸的制备。

　　2. 引物的质量与特异性。

　　3. 酶的质量。

　　4. PCR循环条件。

　　二、 PCR常见问题及对策

　　1. 假阴性，不出现扩增□　条带

　　(1)模板原因

　　① 模板中含有杂蛋白质。

　　②模板中含有Taq酶抑制剂。

　　③模╲板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。

　　④在提取制备模板时丢失过多》，或吸入酚。

　　⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质→量好时，不Ψ 出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　(2)酶失活

　　①需更换新酶→，或新旧↑两种酶同时使用→，以分析是否因酶的活性丧失或不▅够而导致假阴性。

　　②忘加Taq酶或溴乙锭。

　　(3)引物

　　①引物质量。

　　②引物的浓度。

　　③两条引物的浓度是否对称。

　　解决对策：

　　①选定一个好的引物合成单 位。

　　②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做╱琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一※致『，如一条引物有∞条带※，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

　　③引物应高浓度小量分装保⌒　存，防止多次冻融或长期ζ　放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

　　④引物设计不合理▓，如引物长度不够】，引物之间形成二聚体等。

　　(4)Mg2+浓度

　　①浓度过高降低PCR扩增的特异性。

　　②浓度』过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　(5)反应体积的▼改变

　　① 通常进行PCR扩增采○用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;

　　②在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容ㄨ易失败。

　　(6)物理原因

　　①变性对PCR扩增来说相当重︽要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现∮假阴性。

　　②退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

　　③扩增仪或水溶锅内的∏变性、退火和延伸温度有问题。

　　(7)靶序列变异

　　①靶序列◥发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结¤合。

　　②靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。

　　2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　(1)引物设计不合适

　　①选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。

　　②靶序列太短或引物太ぷ短。

　　(2)靶序列或扩增产◣物的交叉污染

　　①整个基因组或大片段的交叉污染。

　　解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶╳序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样☉进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂╲用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

　　②空气中的小片段核酸∩污染，这些小片段比①靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。

　　解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　3. 出现非特↑异性扩增：PCR扩增后出现的条↓带与预计的大小不一致，或大或小，或者同№时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

　　(1) 引物与靶序列不完▲全互补或引物聚合形成二聚体。

　　(2) Mg2+离子浓度过高。

　　(3) 退火温度过低。

　　(4) PCR循环次数 过多有关。

　　(5) 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也▽会出现非特异性扩增。

　　其对策有：必要『时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延∑　伸)。

　　4. 出现︻片状拖带或涂抹带

　　(1)原因

　　① 酶量过多。

　　②酶的质量↑差。

　　③dNTP浓度过高。

　　④Mg2+浓度过高。

　　⑤退火温度过低。

　　⑥循环∑次数过多引起。

　　(2)对策

　　①减少酶量。

　　②调换另一来源的酶。

　　③减少dNTP的浓度。

　　④适当降低Mg2+浓度。

　　⑤增加模板量。

　　⑥减少循环次数。