1. 如何选用特殊细胞系培养基?

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培▲养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

　　2. 何时须更换培养基?

　　视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

　　3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基?

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞◇大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。

　　4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

　　5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

　　6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

　　一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基〖中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。

　　7.Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么?Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

　　HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液ω的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会◆变碱，Hanks液在CO2培养箱中会¤变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

　　8. 细胞之接种密度为何?

　　依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生◣长之一重要原因。

　　9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

　　一般︼仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角☆瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳□　为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养☆基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。

　　10.冷冻管应如何解冻?

　　取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷ζ冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注◆意安全， 预Ψ 防冷冻管之爆裂。

　　11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO?

　　除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无→法生长或贴附之问题。

　　12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处▃理?

　　一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后★应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活¤性降低， 并可减少污染之机会。

　　13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速?

　　欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。

　　14. 细胞冷冻培养基之成份为何?

　　动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞※液中， 必须使用前先行配制完『成。

　　15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

　　冷冻保存使∞用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

　　16.冷冻保存细胞之方法?

　　冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

　　冷冻保↙存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　17. 细胞欲冷冻保█存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

　　18.培养基中是否须添加抗生素?

　　除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

　　19.应如何避免细胞污染?

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁Ψ的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

　　20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理?

　　原则上：直接灭菌后丢弃之。

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开㊣　，用实验〖室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

　　高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒︽性，因而，做剂量反应实验确定⊙抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素←如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

　　1.在无抗生■素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

　　2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

　　3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

　　4.确定抗生素毒性水平ω后，使用◣低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培¤养液培养细胞2～3代。

　　5.在无抗生素的培养基中培养细□胞一代。

　　6.重复步骤4。

　　7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

　　21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状?

　　不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。

　　22.支原体污染会对细胞培养有何影响?

　　支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之①任一数据。故进行实验ぷ前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数◣据方有意义。

　　23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如＠ 何处理?

　　直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

　　24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

　　定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水□　更换之。

　　25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性?

　　培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐↑渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指◣示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长√停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。

　　26. 各种细胞培◣养用的dish，flask是否均相同?

　　不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

　　27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞∴数目太少之情形?

　　研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心◤过程操作上的失误， 造成№细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后↘不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

　　28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

　　研究人员在细胞培★养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或¤血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

　　29. 收到之冷冻管瓶身卐破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因?

　　冷冻管瓶盖裂纹，或瓶◣身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂※损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

　　30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

　　L-谷氨№酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核〗酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率↑一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　31.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

　　GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定▓的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

　　GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相⌒同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

　　32.什么ξ培养基中可以省去加酚红?

　　酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红△色，酸性时」为黄色，碱性时为紫▼色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

　　33.如何用台盼兰计数活细胞?

　　用无血清培养〖基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞◎悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血∑　球计数板计数细胞。活细胞排〗斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。

　　34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

　　丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄●糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以㊣代谢丙酮酸钠。

　　35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

　　二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养『基中所有的二价离子。

　　36.室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?

　　缓冲液PH值随】温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。

　　50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值

　　4°C

　　25°C

　　37°C

　　8.1

　　8.2

　　8.3

　　8.4

　　8.5

　　8.6

　　8.7

　　8.8

　　8.9

　　9.0

　　9.1

　　9.2

　　9.3

　　9.4

　　8.5

　　7.6

　　7.7

　　7.8

　　7.9

　　8.0

　　8.1

　　8.2

　　8.3

　　8.4

　　8.5

　　8.6

　　8.7

　　8.8

　　7.2

　　7.3

　　7.4

　　7.5

　　7.6

　　7.7

　　7.8

　　7.9

　　8.0

　　8.1

　　8.2

　　8.3

　　8.4

　　8.5

　　37.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?

　　我们□推荐使用脱落细胞的方法，此技术◥破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。

　　38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：

　　1. 去除∮培养基。

　　2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞，去除PBS。

　　3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。

　　4. 37 ℃孵育5到10分钟。在◥仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

　　5. 向细胞中加入ぷ2ml 细胞培︼养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)

　　6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。

　　7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

　　39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少?

　　为了防止悬浮培养细胞【聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

　　40.在重♀新冻存sf9细胞前，它可以传多少代?随〓着传代的次数的增加，它的感染能力会√降低吗?

　　通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞∩活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

　　41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?

　　这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值(确定松开瓶∴口以保证气体交换)。

　　42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用?

　　如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现★沉淀，只能丢弃这些培养基。

　　43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?

　　当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生〖素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

　　44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?

　　一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗√生素时，您应该在◣两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

　　45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

　　大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。

　　46.为什么要在〒溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?

　　胰蛋№白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超⌒　过30分钟，就会︻变得不稳定。

　　47.保存血清最好的方法?

　　我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无▃法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放∑回冷冻。

　　48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

　　将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下□　使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

　　49. 血清解冻后发现有絮☆状沉淀物出现，该如何处理?

　　血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂△蛋白的ξ变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋▼白之一)在血清解冻后△，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

　　若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些〓絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

　　50. 为什么要热灭◎活血清?

　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶〗解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时ζ　，推荐使用热灭活血清。

　　51. 有必要做热灭活吗?

　　实验显示，经过正确处理的热灭活血●清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显＠微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以『为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

　　若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!

　　52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

　　有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘々连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免◥反复冻融。

　　53. 如何避免沉淀物的产生?

　　我们建议您在使用血清的时候，注意下列︽的操作:

　　(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。

　　(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

　　(3)请勿将血清置】于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影♀响血清的质量。

　　(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

　　(5)若必须做血清的热灭∩活，请遵守56℃，30分钟◥的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。