高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的分离分◣析技术，是现代↑分离测定的重要手段。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检▅测灵敏度好、能分析高沸点但不▓能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床△分析。高效液相色谱是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂，缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后依次进入检测器，色谱◎信号由记录仪、积分仪或色谱工作站记录。
色谱柱是高效液相色谱的心脏，在高效液相色谱仪的使用中，保持色谱⊙柱的柱效、容量和∞渗透粉性，延长柱子的使用寿命非常重要。因此对高效液相色谱柱的维护是关键。
1 色谱柱〓的构造
色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力∩不高于70㎏/㎝2时，也可采用厚壁玻璃⊙或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱』内壁多经过抛光。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的◣柱接头内装有筛板◥，是烧结不①锈钢或钦合金，孔径0.2-20 μm(5-10μm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规ㄨ格也不同※:
(I)常规分析柱(常量柱)，内径2-5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm )，柱长10-30cm ;
(2)窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1 -2mm ,柱长10-20cm;
(3)毛细管柱(又称微柱)，内径0.2-0.5mm;
(4)半制备柱，内径>5mm;
(5)实验室制备柱，内径20-40rnm，柱长10-30cm;
(6)生↑产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管◣壁效应。
2 色谱柱的使用和维护
在日常分离分析工作中，色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命」，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作≡过程中，需要注意下列问题→，以维护色谱柱※。
(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要↘适度。必须防止较强的㊣ 机械振动，以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次卐数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时△阀的转动不能过缓。
(4)应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部●是水，反之亦然。
(5)如使用柱温控↙制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。
(6)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产●者指明该柱可以反冲时，才可以反〓冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
(7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以⌒在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预ξ先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
(8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护【柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
(9)经常用强溶剂♀冲洗色谱柱，清除保㊣ 留在柱内的杂质。在进行清洗□时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过ξ 渡，每种流动相的体积应是柱体∴积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。
(10)保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干↓燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
(11)色谱柱使用『过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被□ 堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被卐污染;如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
(12)在完成↘分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱︼柱内的杂质。
3 色谱※柱的再生
因为高效液相色谱柱是消●耗品，随着使用时间或进样次数的增加，当出现色谱峰高阵低，峰宽加大或☉出现肩峰时，一般来说可能是柱效下降。
(1 )反相柱的再，采用以甲醇:水=95: 5(V/V),纯甲醇，二氯甲烷等溶剂作流动∩相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱的量为2030倍色谱柱体积然后再以相反顺序冲洗色谱柱。
(2)正相柱再生。顺次Ψ以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺序，不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍柱体积(因异∴丙醇的粘度较大，冲洗过程中请随时注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需严格▅脱水。
(3)离子交换柱的再①生。长时间在高pH值和高离子强度缓冲溶液中使用，将导〖致色谱柱离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗，可使阳离子柱再生;反之，用稀碱缓冲溶液冲洗，可使阴离子柱╱再生。以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法，使用者可根据自己的实际经验和目的，选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相，按正方向或反方向的冲洗。
但是需要指出是，无论采用什么〒方法再生色谱柱，均不可能完全队复柱效或其他参数至新柱水平。
4 色谱柱的发展方向
因强调分析速度→而发展出短柱，柱长3-10cm，填料粒径2-3 μm。为提高分○析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱。细管径柱的优点是:节省流☆动相、灵敏度增加、样品量少、能使用长柱达到高分离度、容易控』制柱温、易
于实现LC-MS联用。
但由于柱体积越∮来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)，更小死体积ζ的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能情密输出1-100μL/min的低流量，进〓样阀能准确、重复地进样〖微小体积的样品。且因上◥样量小，要求高灵敏度的检测器，电化︾学检测器和质谱仪在这方面具有¤突出优点。
