随着现代社会与科学技术的发展，对各种复杂样品分离分析的要求越来越高，特别是在食品安全、环境监测、药物开发、生命科学等领域。“更快、更好的得到分析检验结果”这是广大分析工作者的愿望。2004年美国Waters公司推出了世界第一台最新研制的超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLCTM ) 。UPLC借助HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，它给实验室带来了新奇而强大的能力，成为分离分析的一个新兴的领域。UPLC的出现大大拓宽了液相色谱的应用范围和在分离分析科学中的重要地位，为分析化学工作者提供了又一个强有力的技术手段。
图一：Waters公司 ACQUITY Ultra Performance LC? (UPLC)
1 UPLC的基本原理
采用细粒径填料(117μm)和细内径柱子而获得柱效高达(100，000 -300，000) 的■液相色谱技术， 简称超高∮效液相色谱。UPLC系统是利用创新技术进行整体设计，从而大幅度改善色谱分离度、样品通量和灵敏度的最新液相色谱技术。相对于当今分析速度最快的高效液相色谱(HPLC)，UPLC的分析速度提高了9倍，分辨率提高了2倍，灵敏度提高了3倍，一次分析所得到的信息量大大超过了高效液相色谱。而◣这一分离分析领域的创新，是基于著名的van Deemter方程，该方程是一个描述线速度和理论塔板高度(柱效)之间关系的经验性方程：
上式中， H为塔板高度，A为涡流扩散系数，B为纵向扩散系数， C为传质阻抗系数，μ为流动相流速。由于式中A、C两项与填料颗粒度( dp )之间的关系为： A∝ dp; C∝ ( dp)2 ，因而方程式(1)可表达为：
从式(2)可明显看到，随着色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的塔板高度H也愈小，色谱柱的柱效╳越高，说明柱效(N)与颗粒度( dp)成反比：
另一方面，液相色谱分离度与柱效(N)的平方根成正比：
(4)式中k2是容量因子，α是选择性系数，N是理论塔板数。可见，随着颗粒度dp的降低，柱效N增加，进而Rs值也增加。由于分离能力用峰容量衡量，单位时间的峰容量越高，表明可以分离出的色谱峰越多，分析的◆分辨率越高。这也说明了可以通过减√小色谱柱中装填固定相颗粒度来提高色谱柱的柱效和分离度。除提高柱效和改善分离度外，依据van Deemter理论可进一步推测，减小固定相粒度还可在♂分析速度、灵敏度方面提高色谱分离分析的效能。总而言之，由van Deemter理论可以得到几点启示：色谱柱中装填固定相的颗粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要的因素。首先，颗粒度越小柱效越高;其次，不同的颗粒度有各自最佳柱效的流速;最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提★高分析速度和灵敏度。但是，要真正在技术上实现超高效液相色谱分析，除必须使用小颗粒固定相外，还必须解决色谱系统的一系列问题。如：小颗粒填料的耐压问题和小颗粒填料的装填问题，这包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构;色谱系统的耐压问题，包括超高压下溶剂输送及系统的耐压防渗;快速自动进样与减少进样交叉污染问题;高速检测及扩散问题;高速数据的采集及管理、仪器系统控制问题等。只有达成上述这几个单独领域的技术创新并进行优化组合，才能促成超高效液相色谱的实现。
图二：Agilent 1200快速液相色谱仪
2 实现超高效液相色谱的技术条件
为了使液相色谱的分离效率和分离速度等性能上达到新的高度，UPLC在多项色谱技术方面进行了改进与创新。
1)应用杂化颗粒技术合成了新型全多孔球形117μm反相固定相色谱填料，并采用新型的装填技术，制备了高柱效的色谱柱。
2)制造超高效液相色谱的输液泵。对10 cm长的装填117μm颗粒的色谱柱而言，达到最佳柱效的流速时，其计算的理论柱压约15000 p si。因此需要一个可以在此压力下传送溶剂的泵。另外溶剂在此压力下的压缩性有显著变化，尤其是在多溶剂梯度分离条件下。因此为色谱柱装备了一台用独立柱塞驱动，可进行4种溶剂切换的二元高压梯度泵。此溶剂输送系统在很宽压力范围内具有补偿溶剂压缩▼性变化的能力，并在等度或梯度分离△条件下保持流速的稳定平滑和重现性。
3)超高压液相色谱的高速检测器。就理论而言，使用117μm颗粒填料的UPLC系统可以产生半峰宽小于1秒的色谱峰，这就对UPLC的检测器提出了挑战。首先当色谱峰通过检测器时，检测器必须有一个非常高的采样速度和非常小的时间常数，使它能够在整个色谱峰内捕捉到足够的数据点，以获得准确、可重现的保留时间和峰面积。其次检测器←的流通池死体积要尽可能小，减少谱带扩展以保持高柱效。最后检测器的光学通道要提供能满足UPLC高灵敏度检测要求。因此，使用采样速度达40点/ s或80点/ s，池体积仅为500 nl (约为HPLC池体积的1 /20)的新型光导纤维传导的流通池。当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全折射特征，不损失光能量，而使检测灵敏度比HPLC增加2～3倍。光源可使々用可变波长的紫外光等。
4)低扩散、低交叉污染的自动进样器。在HPLC中进样系统也是非常关键的因素，传统的HPLC中使用的手动或自动进样阀都不是为极端高压情况下设计的。在UPLC中为保护色谱柱不受极端高压力波动的影响，进样过程应当相对无压力波动;进样系统的死体积必须足够小，以降低样品谱带的扩展;快速进样周期可使UPLC在具有高样品容量的同时也实现高速度，并使无人照管、长时间运行的自动进样得以实现，在获得高灵敏度同时还具有极低交叉污染的小体积进样能力。
5)实现系统综合性能的整体优化设计。除了采用以上技术外，还注意各部分之间的连接管线和接头，整体系统的死体积远低于常规HPLC系统，现优化的超低系统体积。同时开发创新软件平台，控制整套设备。
图三：VERTEX公司UPLC P5000超高效液相色谱仪
3 应用
目前，超高效液相色谱技术已先后应用于食品安全、环境分析、药物开发、代谢组学等领域。
3.1 食品安全
YuZhang等应用此技术测定食品中的丙烯酰胺，它提供给我们一种快速定量的方法，仅用3 min 分析完成，结果RSD≤4.5%。催亮等应用UPLC - MS同时测定了牛奶中12种糖皮质激素的残留，以保留时间和离子对(母离子和两个碎片离子)信息比进行定性，以母离子和响应值高的碎片离子进行定量，12种糖皮质激素的加标回收率为69.3%～94.3% ，相对标准偏差为3.5% ～16.7 %。E1BarceLo - Barrachina等用此技术分析食品中的杂环胺，仅在3 min 内就完成了16个组分的分离、分析。CristinanC.Leandro等应用此技术检测婴儿食品中农药残留，对各类相关的婴儿食品中16种农药残留物进行测定，检测限可达1μg/kg，其检测速度为HPLC的215倍，平均回收率范围是85%～119% ，相对标准偏差小于17%。Tomas Kovalczuk等应用此技术分析食品中农药残留物，检测了苹果样品提取物中17种半极性农药，与HPLC比较，此技术提高了样品的通量，降低了溶剂的消耗量。
3.2 药物开发
Li Xiaoqin应用UPLC - 电喷雾串联质谱法分析金莲花中的有效成分，在20 min内分离出50个峰，其中15种有效成份得到了很好的分离，并进行了结构确认，对四种进行了定量，定量限为515，220μg/g。窦志华等应用UPLC/MS - MS分析复方五仁醇胶囊含药血清中木脂素类成分，通过比较复方五仁醇胶囊含药血清、体外制剂、空白血清及对照品提取离子流色谱图，确认进入血液中的木脂素〗类成分。J.Guan等应用此技术同时检测三七中的11种皂苷，相关系数r >0.9968，RSD < 3.1%。Li Xiaojing等应用固相萃取UPLC法分析N-酰胺丝氨酸内脂的5种衍生物(AHLS)，分析时间仅1.5 min，峰可以在浓度低于0.4μm之下观察到，在SPE过程中，通过增加样品装载量，降低洗脱量，能更有效地提高灵敏度。
3.3 环境分析
王静等应用UPLC - MC分析水中的微囊藻毒素，采用固相萃取法富集净化样品。该法在5 min 内即可完成4 种MCYST(LR、RR、LW、LF)的分离及检测; LR、RR、LW、LF的定量检测限、回收率分别△为1.3～6.0 ng/L，91.1%～111%;工作曲线的线性相关系数大于0.99，线性范围达到了3个数量级。Marinella Farre等应用UPLC - TOF - MOS在16 min 内完成了水中痕量雌性激素的测定，从而取代了用45 min 才能完成分析的经典HPLC法。
3.4 代谢组学
Anton Kaufmann等应用UPLC - TOF检测〓了尿样中兽药的残留。这种方法涵盖了100多种不同种类兽药的检测。此法还可检测与尿样有关的某些代谢物，通过监控药物基团与诱导片段的碰撞进一步得到扩展，例子显示CID片段的监控恰好就是磺胺类药物与盘尼西林。Velly A等应用UPLC- TOF - MS检测了人体尿液代谢物中的对酰氨基酚，UPLC /MS比整体柱的灵敏度提高了3倍，产生的峰更⊙尖锐，可用于检测更多的代谢物。Yuanguan Ma等应用UPLC-电喷雾质谱法测定人体血浆中的氨氯地平进行药代动力学研究，定量下限为0.15 ng/ml，精确度RSD < 15% ， RE 2.3% ～6.9%。卢果等应用UPLC-TOF-MS分析尿液中的代谢物，进行区分人类性别的研究，筛选出4种可能与性别相关的生物标准物，结果表明：UPLC /MS联用技术通量高，数据量丰富，模式识别处理方法适合于从大量数据中提取信息，两者结合有利于代谢组学的研究。汪江山等将UPLC /TOF-MS用于人参皂甙Rg3作用后大鼠尿液代谢物指纹图谱分析及标记物的鉴定，对其中2种发生显著变化的代谢物分别通过准确的质量测定得到其元素组成，通过MS/MS技术得到其结构信息，通过检索数据库最终分别鉴定为9，8-二羟基喹啉甲酸和4 -羟基- 2 - 喹啉酸。Gamfeng Wang等应用UPLC /MS分析猴血浆中SCH503034的非对映体，这两种立体异构体R二1.3可在5 min内分离，线性范围1～2500 ng/nl， 在2.5， 50，100 ng/nl浓度时＠ 回收率为87.2% ～90.0% ， 89.1% ～90.4%和92.3%～94.3%。
3.5 其他领域
近年来随着人民生活水平提高，化妆品已进入人们的日常生活中，化妆品的安全性指标亦成为消费者关注的问题。然而，化妆品中所添加的化学物质对人体健康具有潜在的危害，化妆品中添加有害物质，轻则会使皮肤过敏，严重的会有致癌的危险。因此，对化妆品中违禁物的检测十分必要。我国化妆品卫生标准、欧盟化妆品规程中均明确规定糖皮质激素、雌激素、雄激素、孕激素等为化妆品中禁用物质。马强等应用UPLC技术建立了同时测定化妆品中糖皮质激素、雌激素等15种激素分析方法，在6 min 内完成了多组分各类激素的快速分离检测， 15种激素的工作曲线的线性相关系数r均高于019995，在低、中、高(2、10、20 mg/kg) 3个添加水平下， 15种激素的平均回收率为88.2% ～102.4% ，相对标准偏差为1.6% ～7.4%。
4 结论与展望
综上所述，UPLC技术的应用，使液相色谱在更高水平上实现了突破。通过这几年广大的实验工作者的努力实践，使UPLC技术在各行各业得到了很好的应用，这也证明了UPLC技术可行及具有广阔应用前景。我们看到，在实际应用中，由于UPLC的柱颗粒较小，为防止堵塞，样品前处理要求更加严格。由于系统体积及流量的减小，UPLC比HPLC更节省溶剂，从而更环保及节省费用。UPLC的设计成为质谱仪最〇佳入口技术，由于UPLC的流量小，使质谱仪的负╲荷减少，使质谱仪的真空度更好;UPLC分离度的提高，使离子抑制现象减弱，更好的提高了检测器的灵敏度; UPLC灵敏度的提高，使质谱检测器灵敏度得到进一步的提升从而实现了分离与检测的强强联合。UPLC的高分离度可以帮助分析工作者更加从容驾御复杂组分的分离;它的高灵№敏度可以帮助我们解决痕量待测物质分析的难题;同时，它的快速、高通量、节省时间、节约溶剂的优点使UPLC /MS/MS技术成为当今最有效的分离分析工具之一。面对基体复▃杂的混合痕量组分的分析，特别是蛋白质与代谢组→学等生化领域以及天然产物的分析，我们需要精细的微量操作手段和高灵敏度的痕量检测技术。UPLC的出现极大促进了这些领域的发展，并将得到更好的应用。
