大鼠Ⅱ型胶原（ColⅡ）定量检测试剂盒（ELISA）使用说明书 【试剂盒名称】大鼠Ⅱ型胶原（ColⅡ）定量检测试剂盒（ELISA）【试剂盒用途】定量检测大鼠血清、血浆及相关液体样本中Ⅱ型胶原（ColⅡ）的含量。【检测原理】本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被大鼠Ⅱ型胶原（ColⅡ）单克隆◥抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在◣辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅◢与样品中大鼠Ⅱ型胶原（ColⅡ）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中大鼠Ⅱ型胶原（ColⅡ）含量。【试剂盒组成】1 酶标包被板 12孔×8条 7 显色剂A液 6mL2 标准品 0.6mL 8 显色剂B液 6mL3 20倍浓缩洗涤液 25mL 9 终止液 6mL4 样本稀释液 6mL 10 说明书 1份5 标准品稀释液 6mL 11 封板膜 2张6 酶标试剂 6mL 12 密封袋 1个备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：8、4、2、1、0.5、0.25 μg/L【需要而未提供的试剂和器材】1、37℃恒温箱2、 标准规格酶』标仪3、 精密移液器及一次性吸头4、 蒸馏水5、 一次性试管6、 吸水纸【操作步骤】1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶∏标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔】不加。4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。5、洗板：弃去液体，吸水『纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液←，吸水纸上拍△干，如此∑重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对↘照孔不加。7、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。8、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。9、显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，平板混匀器混↑匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔ㄨ的吸光值（OD值）。12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样∞本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。【样本要求】1、样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将标本放于-20℃保存，但应◥避免反复冻融。3、样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。【注意事项】1、实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。2、酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。3、建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份↘检测，取平均值，以减小实验误差。4、牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。5、若显色过浅，可适当延长底物温√育时间。6、为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。7、试剂盒保质期内使用，不同批号的★试剂不得混用。8、底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。【操作程序总结】准备试剂，样品和标准品 加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟洗板4次，加ξ入酶标试剂，37℃反应30分钟洗板4次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟加入终止液15分钟之内读OD值计算【检测范围】0.25μg/L - 8μg/L【规格】96T/盒【贮藏】2-8℃，避光防潮保存。【有效期】6个月