现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择.但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解.
1,正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团 (NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料.
由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品 中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱. 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿
(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等.
2,反相色谱
反相色谱填料ζ 常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相. 反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物. 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有 更强的保留. 常用的反相填料有C18(ODS),C8(MOS),C4(B),C6H5(Phenyl)等.
二,聚合物填料
聚合物调料◇多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙□酸酯等,其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用. 相对与硅◇胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效. 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低.
三,其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化.由︽于其特殊的性质,一般仅限于特殊的 用途.如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料.这种填料的分离不同与硅∮胶基质烷基 键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基 键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由 于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用.氧化铝也可用于HPLC, 氧化铝◣微粒刚性强,可※制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用. 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用, 新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂▅层的多孔氧化锆微球色谱柱,应 用PH范围1～14,温度可达100℃.由于氧化锆填料几年▅才开始研究,加之面临的实验难 度,其重要用途与优势尚在进行中.
怎样选╳择填料粒度
目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um, 5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压.粒度越小,填 充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度, 但不是唯一的因素.如果固定相选择是正』确,但是分离度①不够,那么选择更小粒度的填料 是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而, 3um的色相谱的背压却是5um的2倍.与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更 短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低→粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使 用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱▓的压力. 一,如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;
◆ 使用填充良好的色谱柱;
◆ 尽量减少压力波∏动,避免机械及热冲击;
◆ 使用保护柱及在线过滤器;
◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;
◆ 充分过滤样品及流动相Ψ,尽量避免杂质微粒与强保留成分;
◆ 用稳定的固定相(C18最稳定);
◆ 在中等PH值操作(6~8),用有※机缓冲溶液;
◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃;
◆ 硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;
◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;
◆ 流动相中含有缓冲溶液,应注意应95:5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低︽于5%;
◆ 过夜〗或贮存时,冲洗掉盐和缓冲︾液,用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好).
HPLC固定相及应用范围
名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物.
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最 弱,典型用于中等极性和多官能团化合物.
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质,保留时间比C8和C18短.
MOS C8, -C8H17 √ √ 中等极性相中对中等化合物,小肽和蛋白质,
Octyl 极性药族化合物和环境样品.
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留最强.广 泛用◥于药物,甾族化¤合物,脂肪酸和环境样品.
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性,适合应用于正相
(propyl 分离,当用于反相系统时,其选择性与 C8和 Nitrile) C18不同,在药学领域和复杂混合物的分离中应
用广泛.
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物.弱阴离子▂交
(Amino Propyl) 换 ,阴离子和有机酸则◤应用缓冲剂和有机改性 剂 做流动相.正相中与硅胶的选择性机改性剂
不同,分析芳香族效果很好.
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物
Diol -(CH2)2O √ √ 反相时,分离肽和蛋白质.正相时,与硅选择
CH2(CH2OH)2 性 相似,但极性较弱.
SCX 强阳离子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有机碱交换
SAX 强阴离子 -(CH2)3N+(CH3)3 有机酸,核苷↓和核苷酸交换
二,如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
1.保留值与分离度重现性不好原因分析
问题 原因 表现
不同↓色谱柱间差异 填料,键合相不同 保留因子(k),分离因子(α)
使用期间柱变化 柱床破坏 柱效(N)
键合相∩丢失 保留因子(k),分离子(α)
硅胶ω基质溶解 柱效(N)
强保留分堆积堵塞 保留因子(k),柱效(N)
柱外效应 系统差异,进样量大, 柱效(N)
进样阀与 色谱柱之间,
色谱柱与检测器之间管
路太长,检测器流通池
体积大,接头死体积大等.
分离效果变差 流动相组分改变 保留因子(k),柱效变◥化很小
流速改变 保留因子(k),分离因子(α)
温度改变 保留因子(k),柱效变化很小
柱平衡慢 重新№平衡时间不够 保留因子(k),柱效变化很小
柱超载 样品量太大 保留因子(k),柱效(N)
2.造成色☆谱峰(不对称)拖尾的原因
1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料卐塌陷;
2.柱头有污染;
3样品超载;
4样品溶剂不合适;
5.柱外效应;
6化学或二次保【留(硅羟基)效应;
7缓冲容量不足或不合适;
8重金属污染.
3.如何◣解决峰形拖尾的问题
A.与化学有关的拖尾→问题
1.流动相中,加入30mM的三乙胺(用与碱性化合物)或醋酸胺(用与酸性化合物),未 知化合物加醋酸三乙胺;
2.如仍然拖尾,将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);
3.降低进↑样量至<1ug.
B.与色谱柱有关的拖尾问题
1.如柱头处有强保留的样品组分积聚,反相柱↑可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲 醇,加1%氢氧化铵混合液冲洗,正向柱可用甲醇冲洗.
2.使用保护柱
C.与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽
1.进样体积过大,(通常≤25uL);
2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体〖积过大(最佳连接管应<20cm,内径为0.007〃);
3.检测器流通池的体积过大.
4.如何储存色谱柱
1.防止缓冲溶液和『水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少,或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长,有机改性剂还有助于流动相脱气.
2.尽可能将色●谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴最好)中,避免∑ 在缓冲溶液中保存.
3.使用缓冲溶液后的色谱柱,应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗●色谱柱,后换成100%有机溶剂储存.
4.避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱.
5.将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂.
如何选择保护柱
怎样选择保⊙护柱,但又不能影响分离分析 这是色谱工作者经常提出的一个问题.通常,在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁.对于∮大部分分析工作者来说,一只1cm长的保护柱,那么就应选择2cm或3cm长的保护柱.保护柱越长,自然所装填的色谱填料就越多,则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会.当然,随着保护柱的长度加长,样品的保留时间会比使用短保护柱长.一般来说,保护柱的内径与分析色谱ㄨ柱的内径相同或相当即可.
保护柱的填料装填方式也很重要.目前有薄膜装填法的保护柱,使用过程很简单方便,而且可以在实验室中进行干装.但是,其最大的缺点是不经济,特别是针对中国的具体情况,一次性使用相对费用较高.另外,薄膜装填法的♀保护柱所装填的色谱填料有限,只能提供有限的保护作用;不过也因为所装填的色谱料较少,保护柱的长度也较短,所以对分析样品的保留时间的影响也很小.
另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄,设计方式上有直连式,手紧式或整体式.整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的,必须与色谱分析柱一同订货,可以非常方便地使用,但不能够被修改.直连式结构ぷ设计可在任何时候有色谱工作者来安装连接,可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用,而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度.手上紧即可.另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯.可以降低保护柱的使用成本.
大多数人是根据色谱〗
